卒中T淋巴細胞亞群動態變化及其與卒中相關感染的關系

趙博，楊彬彬，王佳偉

2006年，Vargas等[1]提出卒中相關性感染（stroke associated infection，SAI），將其定義為卒中發病時無感染且不處于感染潛伏期，卒中發病后7 d內發生的感染，以肺部感染和泌尿系感染為主[2]，其發生率為23%～65%，往往會加重病情并影響預后[3]。卒中會打破神經系統與免疫系統之間的平衡，誘導產生外周免疫抑制綜合征（stroke induced immunodepression syndrome，SIDS）[4]，主要表現為廣泛的淋巴細胞凋亡和功能障礙，從而導致感染發病率增加[5]。T淋巴細胞在卒中后機體免疫應答中起關鍵作用[6-7]，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞主要介導細胞免疫，CD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制作用，包括調節免疫炎癥反應、限制病變發展和促進組織修復等[8-9]。卒中后各T淋巴細胞亞群時間和空間的分布更有助于闡明他們在卒中病理生理過程中的作用，然而目前對于該問題仍存在爭議。本研究通過觀察卒中早期患者外周血中CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞及Tregs動態變化，進一步揭示卒中急性期免疫變化相關機制，以及免疫異常對于卒中后感染的影響，為發現新的卒中治療靶點及卒中后感染的預防和治療提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年11月-2015年1月在首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經內科住院治療的卒中患者為卒中組。

入組標準：①年齡≥18歲；②發病24 h內入院；③符合2013年由美國心臟學會（American Heart Association，AHA）/美國卒中學會（American Stroke Association，ASA）的《急性缺血性卒中診治指南》[10]及2010年《自發性腦出血治療指南》[11]中缺血性卒中和腦出血診斷標準，并經頭部計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實；④入院當天美國國立衛生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分≥3分，且卒中前改良Rankin量表（modi fi ed Rankin Scale，mRS）評分≤2分。

排除標準：①痛風、血液系統疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤；②嚴重肝、腎功能障礙；③急性心肌梗死及其他血管栓塞性疾病；④甲狀腺功能亢進及其他慢性消耗性疾病；⑤發病前2周內有感染史、服用雌激素或2周內有外科手術或外傷。

同期無神經系統癥狀和體征的健康體檢者作為對照組。

本研究經首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會批準，所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 感染診斷標準及分組 卒中相關性肺炎的診斷標準：臨床診斷：卒中發生后胸部影像學發現新出現或進展性肺部浸潤性病變，同時合并2個以上臨床感染癥狀：①發熱≥38℃；②新出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴胸痛；③肺實變體征和（或）濕啰音；④外周血白細胞≥10×109/L或≤4×109/L，伴或不伴核左移。病原學診斷：患者咳深部痰進行細菌定量培養，同時排除某些與肺炎臨床表現相近的疾病如肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質病、肺水腫、肺不張、肺栓塞等[12]。卒中后泌尿系感染的診斷標準：①臨床表現：有發熱、尿頻、尿急、尿痛、恥骨上區不適和腰骶部疼痛等癥狀可做出臨床診斷；②尿培養：清潔中段尿培養，菌落計數女性＞105CFU/ml、男性＞104CFU/ml，或導尿患者留取的尿標本細菌菌落計數＞104CFU/ml[13]。

根據發病1周內有無感染，將患者分為感染組和非感染組。

1.3 主要試劑與儀器 3色淋巴細胞亞群試劑CD4/CD8/CD3單克隆抗體（單抗）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的小鼠抗人CD4單抗、別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標記的CD25單抗和同型對照Mouse γ1、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標記的FoxP3單抗和同型對照IgG2a，以及溶血素、FoxP3固定/破膜/洗液，均購自美國BD公司。流式細胞儀購自美國BD公司，分析軟件為Cell Quest Pro系統。

1.4 流式細胞儀檢測 卒中組于發病24 h內、3 d和7 d采取2 ml四乙酸二氨基乙烷（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的外周靜脈血，對照組于清晨空腹狀態下采集2 ml EDTA抗凝的外周靜脈血。標本分裝為2份，分別于檢驗科檢測血常規及在中心實驗室應用流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群，標本均于采集后24 h內測定。

流式細胞術操作方法：①CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T細胞：取抗凝全血100 μl，加入5 μl CD4/8/3單克隆抗體，振蕩器上充分混勻，室溫避光反應25 min；加入溶血素1 ml，充分震蕩混勻，室溫避光10 min，1500 r/min離心5 min棄上清液，加1 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗1次棄上清液，加0.5 ml PBS，振蕩器上充分混勻，立即上流式細胞儀檢測。②CD4+CD25+FoxP3+Tregs：取抗凝全血100 μl，實驗組加入CD25-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，對照組加入IgG1-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，振蕩器上充分混勻，室溫避光反應15 min；加入FoxP3固定/破膜液1 ml，充分震蕩混勻，室溫避光反應30 min，加入FoxP3破膜洗液1 ml，1500 r/min離心5 min洗兩次，棄上清液；實驗組和對照組分別加FoxP3-PE 5 μl、IgG2-PE 0.5 μl，充分震蕩混勻，室溫避光孵育2 h，加0.5 ml PBS，振蕩器上充分混勻，立即上流式細胞儀檢測。

CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞亞群絕對值計算：血常規測得淋巴細胞絕對值×流式細胞術測得相應細胞比例；CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴細胞亞群絕對值計算：血常規測得淋巴細胞絕對值×流式細胞術測得CD3+CD4+T淋巴細胞比例×CD4+CD25+FoxP3+Tregs比例。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料數據均符合正態分布，以表示，卒中組與對照組樣本間采用完全隨機設計方差分析進行檢驗，非感染組與感染組采用兩獨立樣本t檢驗進行檢驗。計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 研究期間連續入組32例卒中患者（缺血性卒中24例，腦出血8例）。所有患者均于發病24 h內就診，缺血性卒中患者中有2例在癥狀出現4.5 h內接受了重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）靜脈溶栓治療。卒中后非感染組24例（缺血性卒中19例，腦出血5例），卒中后感染者8例（缺血性卒中5例，腦出血3例）。感染分別發生在發病后2 d至4 d，其中2例有明確的病原學結果，且均為痰培養草綠色鏈球菌陽性。對照組23例，卒中組與對照組年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高脂血癥、心房顫動史等方面無顯著差異，但卒中組高血壓病史、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史、卒中病史及感染發生率均顯著高于對照組（表1）。

表1 卒中組與健康對照組樣本資料統計

2.2 健康對照組與卒中后非感染組及卒中后感染組各淋巴細胞亞群絕對值比較 健康對照組CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T淋巴細胞亞群絕對值分別為（1.25±0.43）×109/L、（0.67±0.24）×109/L和（0.59±0.28）×109/L，CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴細胞亞群絕對值為（0.05±0.03）×109/L。與健康對照組比較，卒中后非感染組CD3+CD4+T細胞與Tregs于發病后7 d升高（P分別為0.02和0.03）；CD3+CD8+T細胞在發病后24 h及3 d下降（P分別為0.01和0.03），發病后7 d升至與健康對照組無顯著差異。卒中后感染組CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞及Tregs在發病24 h內（P分別為＜0.001，＜0.001，0.03和＜0.001）、3 d（P均＜0.001）、7 d均較健康對照組明顯下降（P分別為＜0.001，0.01，0.01和0.01）（表2）。

表2 卒中后非感染組及卒中后感染組各淋巴細胞亞群絕對值檢測結果及比較（×109/L）

2.3 卒中后非感染組與卒中后感染組各淋巴細胞亞群絕對值比較 卒中后感染組CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞及Tregs在發病后24 h內（P分別為0.01，＜0.001和＜0.001）、3 d（P分別＜0.001，＜0.001和0.04）、7 d（P均＜0.001）均顯著低于卒中后非感染組；兩組CD3+CD8+T細胞在發病后24 h內無明顯差異，但3 d（P＜0.001）、7 d（P=0.02）卒中后感染組顯著低于卒中后非感染組（表2）。

3 討論

卒中是一個復雜的全身炎癥性疾病及自身免疫過程，其發生發展與體內多種免疫細胞和炎癥因子相關，而卒中同樣會影響機體的免疫功能。目前認為SIDS實質為神經-內分泌-免疫調節機制，卒中后下丘腦-垂體-腎上腺軸被激活，交感神經系統活動增強，腎上腺皮質激素分泌增加，交感神經末梢釋放兒茶酚胺類激素增多，從而致外周血、肝臟、脾臟T淋巴細胞數下降及功能降低[14]。最近研究發現，壞死腦細胞中釋放的高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）可直接誘發一系列免疫抑制，包括淋巴細胞減少癥[15]。

目前，關于卒中后各T淋巴細胞亞群時間和空間的動態變化仍存在爭議。Vogelgesang等[16]發現，腦梗死后外周血C D3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞在發病當天即下降，之后逐漸上升，于發病后14 d恢復至與健康對照組無差異，SAI患者各T淋巴細胞亞群下降較非SAI患者下降更為明顯。Urra等[17]發現卒中后外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞及Tregs細胞發病后當天開始下降，第二天降至最低，后逐漸回升；肺部感染者各細胞數明顯低于非感染者。國內臨床研究發現，于入院后24～48 h抽取急性腦梗死患者外周靜脈血，SAI組、非SAI組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T淋巴細胞水平均低于健康對照組，CD8+T淋巴細胞水平均高于健康對照組，且SAI組較非SAI組預后不良[18]。T淋巴細胞減少可能作為卒中后感染的一個預測因素[19]。

本研究發現，卒中后非感染者發病后24 h內即出現細胞免疫功能下降，至發病后7 d免疫功能有所恢復，但Tregs在發病后7 d開始增多，發揮其免疫抑制作用。卒中后感染者在發病后24 h內、3 d及7 d細胞免疫功能明顯低于非感染者，且T淋巴細胞數量減少早于感染發生時，故推測機體細胞免疫功能下降會增加感染風險。卒中后感染者在發病后3 d細胞免疫功能下降最明顯，Tregs的免疫抑制作用可能是其重要原因之一。此外，國內關于感染后機體免疫功能的研究發現，肺部感染患者外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞低于健康對照組，而CD3+CD8+T細胞高于健康對照組[20]。提示感染對于機體免疫狀態的影響不容小覷，推測其在卒中后患者感染發生后的T淋巴細胞亞群數量變化中起重要作用。但目前尚缺乏觀察感染后機體免疫功能動態變化的動物實驗及臨床研究。

導致本研究與既往研究結果不完全一致的原因考慮有：樣本量（尤其卒中后感染患者）相對較少、患者病情嚴重程度差異較大、發病危險因素不同、缺血性卒中及腦出血同時納入、治療藥物對免疫功能影響、觀察時間點不同等。進一步的研究需擴大樣本量，根據患者病情輕重程度分組，延長指標監測時間，納入不合并腦血管病的單純感染患者組等，進一步明確卒中后機體免疫功能變化及其與卒中相關性感染的因果關系，進而闡明相關病理生理機制，為卒中后感染的預防和治療提供理論支持。

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【點睛】本研究對比了卒中急性期患者在發生感染及無感染兩種情況下與健康人群外周血T淋巴細胞亞群的差異，顯示了T淋巴細胞亞群的絕對值在卒中急性期及卒中后感染過程中呈動態變化過程。