核桃渣中單寧酸物質(zhì)HPLC檢測方法的建立

梁國偉 牟德華

1（中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北秦皇島066600）2（河北科技大學(xué)，河北石家莊050018）

單寧酸物質(zhì)是維管束植物常見的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于葉、芽、種子，根和莖的組織。單寧酸物質(zhì)具有抗菌活性，這使得植物可以抵御病菌的攻擊，對草食動物也有影響。單寧酸可以使植物內(nèi)的同化作用變得困難，同時產(chǎn)生一種難聞的味道。單寧酸因其對人類的健康有益而被大家知道，主要表現(xiàn)為一些生物學(xué)特性，包括抗誘變、抗癌和抗氧化的特性。有研究表明，單寧酸的抗氧化能力和它與銅離子螯合的能力有關(guān)。

核桃中的單寧酸種類有很多，而且不同品種核桃中單寧酸的種類和含量也不相同。研究表明，核桃內(nèi)種皮中的單寧酸含量最高。本文以核桃乳生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物核桃渣為原料，建立其單寧酸的HPLC檢測方法，以期為核桃渣的綜合利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

酚酸類：咖啡酸，中國食品藥品檢定研究院；（+）-兒茶素，純度≥94.4%，中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸，，純度≥99.%，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；阿魏酸，純度≥99%，生化試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

類黃酮：無水槲皮素，純度≥98%，生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁，北京化學(xué)試劑公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、冰乙酸，均為色譜純；95%乙醇、乙酸乙酯、鹽酸，均為分析純；超純水。

1.1.3 儀器

島津LC-20AT系列高相液相色譜儀，Lc Solution Lite工作站，UV檢測器，Inertsil ODS-SP反相C18柱（250 mm×4.6 mm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的前處理

將核桃渣粉碎并去除油脂后，過40目篩，備用。

1.2.2 單寧酸的提取

稱取1 g處理好的核桃渣，按照料液比1∶70，提取液為體積分?jǐn)?shù)60%、pH1.5的乙醇溶液，提取溫度70℃，提取時間60 min，超聲波的功率是50 W。將提取液進(jìn)行收集、離心、濃縮得到單寧酸的粗提液。后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取相并氮吹至干，再用5 mL甲醇定容，用于HPLC測定。

2 色譜條件的優(yōu)化

2.1 色譜條件選擇

用2%冰乙酸和乙腈作為流動相分離單寧酸物質(zhì)，通過改變流動相的配比以及濃度梯度，柱溫達(dá)到各峰分離的目的。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性關(guān)系的考察

準(zhǔn)確稱取5 mg沒食子酸、阿魏酸、（+）-兒茶素、咖啡酸、蘆丁、無水槲皮素，溶于10 mL甲醇溶液中。將質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成不同的濃度梯度。在已經(jīng)確定的色譜條件下，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)行HPLC分析。在測定的過程中根據(jù)需要及時調(diào)整濃度。根據(jù)液相色譜的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣量，確定線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。

2.2.2 回收率考察

取已知質(zhì)量濃度的單寧酸提取液加入一定量的各單體酚標(biāo)準(zhǔn)樣品，在已經(jīng)確定的色譜條件下進(jìn)行HPLC測定，計算各組分的加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率（%）=［實測值（mg）－樣品中含量（mg）］/添加值（mg）×100%

2.2.3 精密度考察

日內(nèi)精密度：在24 h內(nèi)，將不同質(zhì)量濃度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液多次進(jìn)樣進(jìn)行測定，每次20 μL，根據(jù)峰面積計算日內(nèi)RSD值。

日間精密度：取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，在不同的日數(shù)內(nèi)進(jìn)行測定，計算日間RSD值。

2.2.4 穩(wěn)定性考察

準(zhǔn)確量取一定體積的單寧酸提取液，在室溫下靜置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h，根據(jù)已經(jīng)確定的色譜條件進(jìn)行HPLC測定，計算各單體酚峰面積的RSD值。

2.2.5 重復(fù)性考察

準(zhǔn)確量取一定體積的單寧酸提取液，根據(jù)已經(jīng)確定的色譜條件進(jìn)行HPLC測定，計算各單體酚峰面積的RSD值。

2.2.6 最低檢測限的考察

取一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合溶液，用甲醇進(jìn)行倍比稀釋。以信噪比S/N=3為標(biāo)準(zhǔn)，測定該色譜條件下的最低檢測量。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件

3.1.1 流動相的選擇

分別選擇1%冰乙酸-乙腈、1.5%冰乙酸-乙腈、2%冰乙酸-乙腈等不同的流動相進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，2%冰乙酸-乙腈作為流動相時，各物質(zhì)的分離度較好，峰形銳，故選擇2%冰乙酸-乙腈作為流動相。

3.1.2 柱溫的選擇

柱溫是影響物質(zhì)分離的一個重要因素。分別考察了25℃、30℃、35℃、40℃等不同的溫度對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，30℃時各物質(zhì)的分離度好，峰形銳，出峰時間適宜。故測定柱溫選擇30℃。

3.1.3 洗脫程序的確定

流動相A為2%冰乙酸，流動相B為乙腈（均過 0.45 μm有機(jī)膜），進(jìn)樣量 20 μL，流速 1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長280 nm。梯度洗脫程序見表1。單寧酸標(biāo)品色譜圖見圖1。

表1 單寧酸梯度洗脫程序

圖1 單寧酸標(biāo)品色譜圖

3.2 定性分析

通過外標(biāo)法進(jìn)行定性分析，結(jié)果見表2。

表2 單體酚物質(zhì)的定性分析

3.3 方法學(xué)驗證

3.3.1 線性關(guān)系

以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算各單體酚物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。通過表3的數(shù)據(jù)可以看出，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量和各物質(zhì)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 單體酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

3.3.2 加標(biāo)回收率

各單體酚物質(zhì)的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表4。由表4可以看出，各物質(zhì)的加標(biāo)回收率在80.66%～108.17%之間，因此該方法測定結(jié)果可靠。

表4 各單體酚物質(zhì)的加標(biāo)回收率

3.3.3 精密度

日內(nèi)精密度和日間精密度的測定結(jié)果見表5。由表5可以看出，各多酚物質(zhì)的峰變異系數(shù)均小于10%，故精密度良好，符合測定的要求。

表5 不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的日內(nèi)和日間的RSD值

3.3.4 穩(wěn)定性

各多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性結(jié)果見表6。由表6可以看出，各單體酚物質(zhì)的變異系數(shù)均小于10%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性RSD值

3.3.5 重復(fù)性

各多酚物質(zhì)的重復(fù)性結(jié)果見表7。由表7可以看出，各單體酚物質(zhì)的變異系數(shù)均小于10%，重現(xiàn)性良好，符合測定的要求。

表7 多酚物質(zhì)的重復(fù)性RSD值

3.4 樣品檢測的結(jié)果

根據(jù)確定的色譜條件測得核桃渣中的單寧酸含量，結(jié)果見表8。由表8可知，核桃渣中含有沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、蘆丁和槲皮素等多酚物質(zhì)，阿魏酸未檢出。其中沒食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

表8 核桃渣中多酚物質(zhì)的含量

4 結(jié)論

以2%冰乙酸和乙腈為流動相，調(diào)整比例后進(jìn)行洗脫，各單體酚物質(zhì)的峰得到很好的分離。經(jīng)過方法學(xué)的驗證，各物質(zhì)的線性關(guān)系良好，回收率在80.66%～108.17%之間。方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，測定結(jié)果可靠。

核桃渣中多酚物質(zhì)的含量均不同。核桃渣中含有沒食子酸、咖啡酸、兒茶素、槲皮素和蘆丁，其中沒食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

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