HPLC波長切換法同時測定金嗓散結膠囊中的(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A△

譚雄斯，龐武耀

(肇慶醫學高等專科學校，廣東 肇慶 526020)

·中藥工業·

HPLC波長切換法同時測定金嗓散結膠囊中的(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A△

譚雄斯*，龐武耀

(肇慶醫學高等專科學校，廣東 肇慶 526020)

目的建立金嗓散結膠囊中(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的同時測定方法。方法采用HPLC法，應用Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-乙腈(3∶1)與0.4%磷酸溶液為流動相，進行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；供試品采用50%甲醇超聲提取。結果(R，S)告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的線性范圍分別為4.150～83.00、5.120～102.4、11.07～221.4、4.590～91.80、8.140～162.8 μg·mL-1，相關系數分別為0.999 2、0.999 9、0.999 4、0.999 7、0.999 5；5種成分分離良好，陰性對測定無干擾，平均加樣回收率及相應的RSD分別為99.06%(1.27%)、99.54%(1.15%)、98.19%(0.89%)、97.88%(1.71%)、97.22%(0.99%)。結論所建立的方法可用于金嗓散結膠囊的質量控制。

金嗓散結膠囊；(R，S)-告依春；羥基紅花黃色素A；丹酚酸B；木蝴蝶苷B；木蝴蝶苷A；波長切換法；中成藥多組分測定

金嗓散結膠囊質量標準收載于《衛生部頒藥品標準》中藥成方制劑第十二冊，臨床上主要用于熱毒蓄結、氣滯血瘀而形成的慢喉喑及由此而引起的聲音嘶啞等癥狀的治療，該制劑是由板藍根、紅花、丹參、木蝴蝶等十余味中藥材加工而成的膠囊劑，其標準中未對任何成分進行定量測定[1]，文獻報道也未檢索到對該制劑中多組分進行含量的同時測定，為更好地確保臨床用藥安全及該制劑的質量，本文建立了一種較為簡便的HPLC波長切換法，對金嗓散結膠囊中的4味中藥材中的5個成分[板藍根[2]中的(R，S)-告依春、紅花[2]中的羥基紅花黃色素A、丹參[2]中的丹酚酸B及木蝴蝶中的木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A]同時進行了含量測定，為提高該制劑的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色譜儀；METTLER十萬分之一電子天平(瑞士)；KQ-250B超聲波發生器(昆山市超聲波儀器有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純；磷酸為分析純；對照品(R，S)-告依春(111753-201505)、羥基紅花黃色素A(111637-201609)、丹酚酸B(111562-201615)和木蝴蝶苷B(111915-201202)(中國食品藥品檢定研究院)；對照品木蝴蝶苷A(31567-75-6)(上海同田生物技術股份有限公司)。

金嗓散結膠囊來源于西安碑林藥業股份有限公司，規格：每粒裝0.4 g，批號見表7。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

取對照品(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A各適量，精密稱定，分別用50%甲醇溶解并稀釋制成一定濃度的單一成分對照品儲備溶液[(R，S)-告依春0.415 mg·mL-1、羥基紅花黃色素A 0.512 mg·mL-1、丹酚酸B 1.107 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.459 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.814 mg·mL-1]，再分別精密吸取各對照品儲備溶液適量置同一量瓶中，用50%甲醇制成含(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A分別為8.3、25.6、110.7、45.9、40.7 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取金嗓散結膠囊適量，傾出內容物，研成細粉，取約0.5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，采用KQ-250B超聲波發生器超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失重量，振搖均勻，過濾，作為金嗓散結膠囊供試品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備

按金嗓散結膠囊質量標準項下的處方工藝，制備缺板藍根、紅花、丹參和木蝴蝶的陰性樣品，再按照上述方法制備陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件

使用Agilent HC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：甲醇-乙腈(3∶1)，流動相B：0.4%磷酸溶液，梯度洗脫[3-7](0～14 min，20.0%A；14～25 min，20.0%A→42.0%A；25～30 min，42.0%A→60.0%A；30～35 min，60.0%A→20.0%A)；0～14 min時在245 nm[8]波長下檢測(R，S)-告依春，14～20 min在403 nm[9]波長下檢測羥基紅花黃色素A，20～35 min在280 nm[10-12]波長下檢測丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.5 系統適用性與專屬性試驗

精密吸取上述制備的3種溶液各適量，按照2.4項下色譜條件檢測，檢測結果顯示，陰性樣品溶液的色譜圖中，在混合對照品溶液和供試品溶液所顯示的(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A對應的位置無干擾，且分離度符合要求，理論塔板數均大于2500。見圖1。

注：A.樣品；B.對照品；C.陰性；1.(R，S)-告依春；2.羥基紅花黃色素A；3.丹酚酸B；4.木蝴蝶苷B；5.木蝴蝶苷A。圖1 樣品、對照品、陰性樣品HPLC圖

2.6 線性范圍考察

取(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A 5個對照品儲備溶液，分別精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋，制成6個不同質量濃度的混合對照品溶液，依法進樣測定，記錄峰面積，得線性回歸方程，見表1。

表1 線性關系試驗結果(n=6)

2.7 精密度試驗

取2.1項下制備的混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，結果(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A峰面積的RSD分別為1.17%、1.05%、0.61%、0.73%和0.85%(n=6)。

2.8 穩定性試驗

取金嗓散結膠囊(批號：201510023)同一份供試品溶液，于室溫下分別在0、2、4、6、8、12 h進樣測定(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的峰面積，結果所測5個成分峰面積的RSD分別為1.08%、0.76%、0.57%、0.69%和0.92%，供試品溶液中5個成分在室溫條件下12 h內很穩定。

2.9 重復性試驗

取金嗓散結膠囊樣品(批號：201510023)6份，按2.2的方法制備供試品溶液，依法測定，分別計算(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量，結果所測5個組分含量的RSD依次為1.42%、0.97%、1.03%、0.56%和1.24%。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的金嗓散結膠囊(批號：201510023)適量，傾出內容物，研成細粉，取6份，每份約0.25 g，精密稱定，精密加入質量濃度分別為(R，S)-告依春0.228 mg·mL-1、羥基紅花黃色素A 0.702 mg·mL-1、丹酚酸B 0.459 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.671 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.882 mg·mL-1的單一成分對照品溶液1.0、1.0、5.0、2.0、1.0 mL，按2.2項下方法制備加樣回收樣品溶液，依法測定，計算所測5個組分的回收率及RSD，結果見表2～6。

表2 (R，S)-告依春加樣回收率試驗(n=6)

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(n=6)

表4 丹酚酸B加樣回收率試驗(n=6)

表5 木蝴蝶苷B加樣回收率試驗(n=6)

表6 木蝴蝶苷A加樣回收率試驗(n=6)

2.11 樣品測定

取3批金嗓散結膠囊，按2.2的方法制備金嗓散結膠囊供試品溶液，在2.4色譜條件下進樣，測定(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量，結果見表7。

表7 含量測定結果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 待測成分的選擇

金嗓散結膠囊為中藥復方制劑，板藍根、紅花、丹參、木蝴蝶為方中的主要藥物，板藍根為十字花科植物菘藍的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功能，其主要有效成分為(R，S)-告依春；紅花具有散瘀止痛、活血通經的功能，其主要藥效成分為羥基紅花黃色素A；丹參具有活血祛瘀、涼血消癰的功能，丹酚酸B為丹參的主要成分之一；木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟種子，具有清肺利咽的功能，主要用于肺熱咳嗽、喉痹、音啞等病癥的治療，其主要成分為木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。本文采用高效液相波長切換聯合梯度洗脫法，同時對金嗓散結膠囊中的主要成分(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A進行同時測定，為確保產品質量穩定性和療效一致性提供數據支持。

3.2 流動相的確定

本文作者在流動相的選擇上，首先參考2015年版《中華人民共和國藥典》板藍根藥材項下(R，S)-告依春的流動相(甲醇-0.02%磷酸溶液)和木蝴蝶藥材項下木蝴蝶苷B的流動相(甲醇-0.2%磷酸溶液)，選取甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相，不同比例梯度洗脫，結果所測成分(R，S)-告依春、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A能達到有效分離，但羥基紅花黃色素A達不到有效分離，丹酚酸B拖尾現象嚴重；同時又參考丹參藥材項下丹酚酸B的檢測流動相(乙腈-0.1%磷酸溶液)和參考文獻[9]中羥基紅花黃色素A的檢測流動相(乙腈-0.4%磷酸溶液)，選取乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相不同比例梯度洗脫，結果所測成分(R，S)-告依春峰形較差；在此基礎上作者經過不斷對比實驗，以基線平穩情況、分離度、拖尾因子、噪聲干擾等各種因素為指標，最終選取甲醇-乙腈(3∶1)與0.4%磷酸溶液為流動相，按照文中的梯度洗脫程序對所測5個成分進行同時測定。

高效液相波長轉換聯合梯度洗脫法同時測定金嗓散結膠囊中5種主要成分，操作簡便，通過系統適用性與專屬性試驗、線性關系考察等一系列的方法學驗證，該方法可以作為金嗓散結膠囊的質量控制標準。

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SimultaneousDeterminationof(R，S)-goitrin，HydroxysafflorYellowA，SalvianolicacidB，Baicalein-7-O-diglucosideandBaicalin-7-glucosideinJinsangSanjieJiaonangbyHPLCWavelengthSwitchingMethod

TANXiongsi*，PANGWuyao

(ZhaoqingMedicalCollege，GuangdongZhaoqing526020，China)

Objective：To develop a method for simultaneous determination of the content of (R，S)-goitrin，hydroxysafflor yellow A，salvianolic acid B，baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside in Jinsang Sanjie Jiaonang.MethodsAn HPLC method was adopted for the analysis，which was performed on a Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)chromatographic column with the mobile phase of methanol-acetonitrile(3∶1)(A)-0.4%phosphoric acid solution(B)in a gradient elution，the flow rate of 1.0 mL·min-1，and the samples were preprocessed with ultrasonic extraction in 50% methanol solution.ResultsThe linearity ranges of(R，S)-goitrin，hydroxysafflor yellow A，salvianolic acid B，baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside were 4.150-83.00 μg·mL-1(r=0.999 2)，5.120-102.4 μg·mL-1(r=0.999 9)，11.07-221.4 μg·mL-1(r=0.999 4)，4.590-91.80 μg·mL-1(r=0.999 7)，8.140-162.8 μg·mL-1(r=0.999 5)，respectively.The five components were separated perfectly without disturbing peaks from negative samples.The average recoveries and the corresponding RSD were 99.06%(1.27%)，99.54%(1.15%)，98.19%(0.89%)，97.88%(1.71%)，97.22%(0.99%)，respectively.ConclusionThe method can be applied to the quality control of Jinsang Sanjie Jiaonang.

Jinsang Sanjie Jiaonang；(R，S)-goitrin；hydroxysafflor yellow A；salvianolic acid B；baicalein-7-O-diglucoside；baicalin-7-glucoside；wavelength switching method；multicomponent determination of Chinese patent drug

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.021

肇慶市科技創新指導類項目[肇科(2017)33號文]

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譚雄斯，藥師，研究方向：藥物分析、質量標準研究等；E-mail：tanxiongsizhaoqing@163.com

2016-12-13)