甘肅省黃芩灰霉病的發生及其病原鑒定

王艷，杜弢，曾翠云，陳紅剛

(甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030)

·中藥農業·

甘肅省黃芩灰霉病的發生及其病原鑒定

王艷1*，杜弢1，曾翠云1，陳紅剛1

(甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030)

目的據2013—2016年調查，甘肅省黃芩灰霉病發生嚴重，常年發病率為10～15%，嚴重度2～3級。本研究旨在明確該病在甘肅省的發生情況及其病原菌的分類地位，為該病的防控提供一定的理論依據。方法通過植物病害田間調查確定病害發生情況，將形態學和分子生物學方法相結合確定病原分類地位。結果黃芩灰霉病癥狀主要表現為在葉片和莖稈上形成褐色病斑，嚴重時整株葉片干枯，植株死亡。病原菌分生孢子梗褐色，多隔，長寬450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm；分生孢子長橢圓形至橢圓形，無色，大小8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(平均10.6×7.3) μm。基于形態學和rDNA ITS基因片段構建的系統發育樹分析，將黃芩灰霉病病原鑒定為灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)。結論黃芩灰霉病在甘肅省各個黃芩產區均有發生，依據病害傳播規律，將栽培措施和藥劑噴施相結合進行病害的防治。

黃芩；灰霉病；形態學；系統發育分析；病原鑒定

黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi為唇形科多年生草本植物，性寒、味苦，具清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，常用于治療濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽等癥[1-2]，是我國常用的大宗藥材之一。野生黃芩主要分布于我國長江以北大部分地區，河北承德為其道地產區，素有“熱河黃芩”之稱[3-4]。隨著黃芩的應用范圍的擴大和市場需求量的逐年增大，自20世紀 90年代開始，我國許多省區開始野生馴化和人工栽培黃芩[5]，目前在我國黑龍江、山西、河北、甘肅、山東、內蒙古等地形成了新的栽培產區，在甘肅省隴南、天水、蘭州、金昌、武威等地區均有大面積的種植[6-7]。

但是隨著人工栽培黃芩面積的逐年擴大，黃芩病害已成為制約其產量和品質的重要因素之一。國內目前報道黃芩真菌性病害主要有5種，分別為：白粉病ErysiphecichorocearumDC.[8]、根腐病Fusariumspp.、莖枯病PhomaasparageSacc.[9]、灰霉病BotrytiscinereaPers.和灰斑病PhyllostictamenthaeBres.[10-11]。其中灰霉病是其主要病害，在各產區均有發生。河北承德在2008—2009年對河北省黃芩灰霉病進行了系統的調查和研究，并提出了一定防治建議[11]。在我省該病自2011年在隴西縣被首次發現，病害發病率為10%，嚴重度為1～2級[10]，近年來該病已擴展至渭源、隴西、和政、天水等地，病害發病率上升至10～15%，嚴重度2～3級，呈現逐年擴大的趨勢。目前國內對黃芩灰霉病的病原僅進行了形態學的鑒定，本文旨在通過調查確定黃芩灰霉病在甘肅省的發生情況，并通過形態學和分子生物學相結合的手段對該病的病原進行準確鑒定，為該病的有效防治提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 調查時期、地點和方法

2013年7月至2016年10月，對甘肅省定西市渭源縣鍬峪鄉大田、隴西縣藥材示范園及大田、和政藥用植物園等的22個田塊，在苗期、成株期、采收期進行了黃芩灰霉病的調查，采取“Z”字型5點取樣，每點調查10株，記載發病率，嚴重度。采集典型病株，壓制標本，以備病原分離及鑒定。

1.2 病原菌的分離

選取葉部和莖干上癥狀典型病斑，切取病健交界處組織，在0.1%升汞中消毒1 min，用無菌水沖洗3次后，轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上，置于25 ℃下黑暗培養，5天后進行純化并于4 ℃下保存備用。

1.3 致病性測定

在PDA上培養7d的菌落上加入無菌水，并用滅菌的玻棒刮取分生孢子，配制成濃度為每亳升1×104個的孢子懸浮液，用手動噴霧器噴灑于室內盆栽黃芩植株葉片表面，以噴灑無菌水的植株作為對照。將所有植株分別置于密封的塑料小溫室內，在12 h光照/12 h黑暗的條件保濕24 h后，取出置于室內，每天觀察記錄發病情況，并對接種后發病的葉片進行病菌再分離。

1.4 病原菌形態學特征觀察

對采集的病害標本描述癥狀，光學顯微鏡下觀察病原形態，測定分生孢子梗及分生孢子的大小，觀察培養病菌培養特性，參照文獻[12-13]進行病菌鑒定。

1.5 病原菌核糖體DNA-ITS序列的PCR擴增與分析

1.5.1 病原菌DNA的提取 將菌株接種到PDA平板上進行培養，并用封口膜將培養皿封住，25 ℃培養箱中黑暗培養7d后，用滅菌的解剖針刮取菌絲體，應用真菌基因組DNA的提取采用UNIQ-10 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司生產Sangon Biotech(Shanghai)Co.，Ltd.)提取病原菌DNA。

1.5.2 rDNA ITS的PCR擴增 ITS rDNA的PCR擴增采用真菌的通用引物，正向引物ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C，反向引物ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC[14]，由上海生工生物工程公司合成。PCR反應體系總體積50 μL，反應液為：10×PCR buffer(含MgCl220 mmol·L-1)5 μL，dNTP (10 mmol·L-1)0.5 μL，引物ITS1和ITS4各2.5 μL(10 μmol·L-1)，Taq酶(2 U·μL-1)2 μL(以上試劑由生工生物公司合成和提供)，模板DNA 2 μL，在Biometre PCR擴增儀((Biometra Tg PCR，德國)上進行擴增。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 sec，53 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像儀進行觀察并照相。PCR產物委托生工生物工程(上海)有限公司進行純化和測序。

1.5.3 序列及系統發育分析 經測序所得菌株完整的ITS序列在 GenBank登錄，并進行BLASTn搜索，下載相似序列以及葡萄孢屬的19種菌的ITS序列，選用核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(登錄號：GU229817)作為外群，用Clustal X(1.81)進行多重序列比對(multiple alignment)，通過 MEGA 6.0采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 癥狀

病原菌主要為害葉片、葉柄、嫩莖、花器。葉片多自葉緣發病，向內擴展呈長橢圓形褐色病斑，稍現輪紋，常在葉背長出灰褐色霉狀物，粗壯的分生孢子梗肉眼可見，莖稈受害產生大型長條形病斑，莖稈四周的霉狀物如毛刷狀(見圖1A)，上部組織全部變褐，全株葉片干枯死亡(見圖1B)。殘花上亦長出褐色絲狀物及灰色孢子球。

2.2 病原

挑取組織上病原觀察，病原菌菌絲無色至淡褐色，粗1.2～1.8。分生孢子梗褐色，多隔，長寬450.0～716.6 μm ×9.4～18.8 μm，直或稍彎曲，壁上有小瘤突。分生孢子長橢圓形、橢圓形。無色，一端稍細，大小8.2～16.5μm×5.9～8.2(平均10.6×7.3)μm。該病在我省隴西、渭源、和政大田均有發生，發病率10～15%，嚴重度2～3級。

注：A.莖稈、葉片上癥狀；B.田間病株圖1 黃芩灰霉病癥狀

2.3 致病性測定

將通過常規組織分離獲得的菌株TCM-106在室內接種健康植株，經接種的葉片5 d后即出現明顯褪綠小型斑點，迅速擴展成不規則形小型斑塊，10 d后葉片上癥狀明顯，對照不發病。對接種發病后的病斑再次進行病菌的分離，可獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據柯赫氏法則，證明接種菌為黃芩灰霉病的致病菌。據菌株的形態特征和培養特性，初步確定該病原菌為葡萄孢屬真菌(Botytissp.)。

2.4 黃芩灰霉病病原rDNA ITS系統發育研究

經ITS1和ITS4引物對病原菌進行PCR擴增和測序，得到長度為517 bp的rDNA-ITS序列，將序列提交至Genbank，獲得登錄號為KX100100。在GenBank中搜索并下載同源序列，構建系統發育樹(圖2)。該系統發育樹共22個菌株，包括外群S.sclerotiorum(登錄號：GU229817)，從系統發育樹可見，黃芩灰霉病菌(TCM-106)與4株Genbank登錄號分別為：AJ716294，KR094468，KP025968，KJ744343的灰葡萄孢菌B.cinerea聚類在一個分支上。因此，通過形態學和分子生物學相結合，確定黃芩灰霉病的病原為灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.

圖2 黃芩灰霉病菌(TCM-106)ITS rDNA序列分析

3 討論

3.1 病原

灰葡萄孢(無性態：BotrytisPers.，有性態：BotryotiniaWhetzel)是一種重要的植物病原菌，生長期和貯藏期的作物均可被侵染而引起灰霉病，癥狀表現為花腐、果腐及葉斑，病處形成大量的灰色霉層，即分生孢子梗和分生孢子[15]。該屬真菌共包括了22個種和一個雜交種[16]，大多數種寄主范圍較窄，只侵染一個或幾個相似種的寄主，灰葡萄孢(B.cinerea)侵染范圍最廣，可侵染200多種植物[15]。在甘肅省藥用植物病害調查中發現，有多種藥用植物發生灰霉病，其中當歸、甘草、黨參、知母、紫菀等的灰霉病均由灰葡萄孢B.cinerea.侵染引起[10]。在藥用植物種植過程中，一定要明確該病的病原，才能采取有效的防治措施，以免造成不必要的損失。

3.2 黃芩灰霉病的防治建議

針對黃芩灰霉病提出以下防治建議：(1)黃芩灰霉病菌多以菌絲體在病殘體上越冬，因此，初冬需徹底清除田間病殘組織，減少越冬菌源，可減輕來年病害的發生；(2)目前灰霉病在溫棚中多有發生，溫棚黃瓜、西葫蘆、西紅柿、茄子以及多種花卉上的灰霉菌可直接傳至黃芩引起侵染，特別是棚膜揭開后，孢子大量飛散，為周圍黃芩等植物提供了大量菌源，因此黃芩種植地遠離溫棚和大棚蔬菜；(3)該病在低溫、高濕條件下發生嚴重，降雨多、露時長、濕度大、植株過密等條件下病害發生嚴重，因此種植過程中需降低田間濕度，注意通風透光；(4)必要時需采用藥劑防治措施，可在發病初期噴施2%多抗霉素水劑200倍液、50%乙烯菌核利可濕性粉劑1000～1500倍液、40%嘧霉胺可濕性粉劑800～1000倍液、25%咪鮮胺乳油2000倍液及50%異菌脲可濕性粉劑1000倍液及65%硫菌·霉威可濕性粉劑1500倍液。

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PathogenIdentificationofGrayMoldonScutellariabaicalensisinGansuProvince

WANGYan1*，DUTao1，ZENGCuiyun1，CHENHonggang1

(GansuUniversityofChineseMedicine，Lanzhou730000，China)

Objective：During disease surveys on medicinal plants in Gansu province in 2013-2016，we found that gray mold onScutellariabaicalensiswas a serious disease with 10～15% disease incidence and 2～3 level of disease severity.The study of the disease incidence and the pathogen identification will provide scientific basis to the control of the disease.MethodsThe disease incidence in Gansu province was determined by field surveys.Morphological and molecular methods were combined to identify the pathogen.ResultsThe disease leads to leaf lesions and plant blight.The conidiophore of the causal pathogen is brown，multi septate，450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm in size；the conidia is aseptate，colorless，ellipsoidal，8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(mean=10.6×7.3)μm in size.Based on morphological characteristics and rDNA internal transcribed spacer sequence analysis the fungi is identified asBotrytiscinereaPers.S.baicalensisgray mold appears in all the planting areas in Gansu province.ConclusionThe cultivation methods and chemical control methods should be combined to control this disease.

Scutellariabaicalensis；gray mold；morphology；phylogenetic analysis；pathogen identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.016

國家自然基金項目(31460013)；甘肅省自然基金(17JR5RA164)；甘肅省科技計劃基礎研究創新群體(1606RJIA323)；中央財政引導地方科技創新平臺項目；省自然基金(1508RJZA011)

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王艷，副教授，研究方向：藥用植物病理學；Tel：(0931)8765393,E-mail：gswangyan101@163.com

2017-07-04)