紫蘇醛型紫蘇不同種質中紫蘇醛含量變化規律研究

張琛武，李衛萍，郭寶林*，魏長玲

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫科大學，山西 太原 030002)

·中藥農業·

紫蘇醛型紫蘇不同種質中紫蘇醛含量變化規律研究

張琛武1，2，李衛萍1，郭寶林1*，魏長玲1

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫科大學，山西 太原 030002)

目的研究紫蘇醛型種質紫蘇醛含量變化規律。方法建立紫蘇醛含量檢測的快速方法，對9個不同種質的紫蘇葉進行不同日期、部位和時間取樣，并測定紫蘇醛含量。結果和結論9個紫蘇醛種質的紫蘇醛平均含量為0.05%～0.32%，有4個種質的平均含量在0.25%以上。一般來說頂部葉紫蘇醛含量最高，而且變化較大，開花前出現高峰值，之后驟降；中部葉紫蘇醛含量明顯低于頂部葉，一般開花前達到峰值后，含量較穩定；底部葉紫蘇醛含量最大值出現在花果生長期，隨后一直下降。不同種質也不甚一致。種質因素是影響紫蘇醛含量的首要因素，采摘部位和采樣日期次之，一天內的采摘時間則影響不大。

紫蘇；紫蘇醛；液相檢測；含量變化；種質

紫蘇因揮發油中主要成分不同而分為不同的化學型[1]，《中華人民共和國藥典》(2015年版)規定紫蘇葉中紫蘇醛為檢出成分，即只有紫蘇醛型紫蘇葉為合格藥材。《日本藥局方》(第17版)則規定紫蘇葉中的紫蘇醛含量不得低于0.08%。本研究組前期調查研究發現，國產的紫蘇葉藥材以43份樣品中27份為紫蘇酮型(PK型)，紫蘇醛型(PA型)13份中僅有6份來自于栽培資源(其中2份為來自日本種源，并出口日本)，剩余是其他化學型[2]，又將調查獲得的50份果實種植后檢測，PK型33個，PA型8個(且多數直接或間接來自于日本)，以及其他化學型[3]。而PK型紫蘇因為其中所含紫蘇酮的毒性問題應擯棄使用[1]，針對當前正確的紫蘇醛型紫蘇資源短缺，本研究組搜集了9份紫蘇醛型紫蘇種質，進行種植后種質評價，本文報道這些種質在生長發育過程中紫蘇醛的含量變化規律。

1 儀器和材料

1.1 儀器和試劑

PerkinElmer Flexar 液相色譜儀、Agilent C18色譜柱(4.6×250 μm，5 μm)、ZD-85氣浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)、KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)

紫蘇醛對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：KR16-SW6P，純度≥98%)、甲醇(分析純，北京化工廠)、乙腈(色譜純，Fisher Scientific)、水(娃哈哈飲用純凈水)

1.2 種質來源

9份不同的種質的來源和主要特性見表1。c4l和c4z為紫蘇變種，其余為回回蘇變種。2016年種植在藥用植物研究所實驗地，種植方法參見文獻[2]。

表1 種質來源和主要特性

注：*表示c4l和c4z是同一來源的不同分化類型，區別為葉面顏色不同。

1.3 紫蘇生長發育時期和采樣時間

9個種質中的生長發育期大多一致，集中在9月21日抽穗(也稱開花前期)，10月1日開始結實，10月11日結實，9月21日之前是營養期，9月21日-10月11日是開花期，10月11日～10月31日是結實期。有差異者大約10～20天，具體參見表2。

表2 紫蘇種植和生育期情況

注：—：直播未移栽；*：未能獲得具體時間。

1.4 采樣方法

紫蘇葉采摘分為三個部位，頂部葉設定為主枝及側枝尖端新生葉向下2～3分枝結節內嫩葉(簡稱頂)；中部葉設定為主枝及側枝中間成熟葉片(簡稱中)；底部葉設定為主枝及側枝基部向上4～5結節分枝的老葉(簡稱底)。采樣時間從2016年8月23日開始到2016年10月31日結束，每10天左右采集一次樣本，每一次采樣，隨機選取15～20株，每株摘取葉片一枚，合并為一個樣品。每天采樣時間分早(7：00)、中(12：00)、晚(17：00)。采好的樣品于通風避光處陰干。

1.5 數據分析方法

利用SPSS 19.0和WPS 2016對數據結果進行處理分析和繪制相應圖例。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液制備

精密移取100 μL紫蘇醛，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，搖勻。準確移取2.5 mL到25 mL容量瓶中用甲醇定容，得到0.1 μL·mL-1紫蘇醛對照品母液。

2.2 樣品溶液制備

紫蘇葉研碎成粉末，精密稱取0.5 g，準確移取加入25 mL甲醇，搖床震搖10 min，超聲5 min，靜置，吸取適量上清液，過0.45 μm有機濾膜，進行液相檢測。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(5 μm，4.6×250 μm)柱；流動相：乙腈：水(65：35)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；進樣量：30 μL。

2.4 標準曲線繪制

精密吸取標準溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，靜置，吸取適量，過0.45 μm有機濾膜，到液相小瓶中，進行液相檢測。

2.5 精密度

取同一樣品溶液，連續進樣6針，測定紫蘇醛含量。結果樣品的的平均含量為0.07%，其RSD為0.89%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.6 重復性

取同一樣品6份，按樣品測定方法操作，測定紫蘇醛含量。結果樣品的的平均含量為0.07%，其RSD為1.97%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.7 穩定性

取同一樣品溶液在0、2、4、8、12、24、48 h內，測定紫蘇醛含量。結果樣品的的平均含量為0.07%(n=7)，其RSD為1.09%，表明方法穩定性良好

2.8 回收率

精密稱取已知含量的紫蘇葉粉末0.5 g，按紫蘇醛含量1∶0.5、1∶1、1∶1.5各三份加入相當量的紫蘇醛標準溶液，按樣品測定方法進行測定，計算加樣回收率，結果紫蘇醛的平均回收率為99.03%，RSD為1.83%(n=9)。

3 實驗結果

表3 9個種質紫蘇葉中紫蘇醛含量測定結果 (%)

表3(續) (%)

4 討論

4.1 影響紫蘇醛含量變化主要因素分析

利用SPSS 19.0進行單因素方差分析，綜合考察不同因素對紫蘇醛含量的影響程度，得到方差分析結果(見表4)。

表4 多因素方差分析

a.R2=0.600(調整 R2=0.585)

結果顯示，種質、采摘部位和采樣日期這三個因素對紫蘇醛含量影響顯著，顯著性程度：種質>采摘部位>采樣日期，而采摘時間的影響不顯著，沒有統計學意義，尚不能認為不同采摘時間的紫蘇醛含量有差別。

4.2 不同種質

各紫蘇種質的紫蘇醛平均含量在0.05%～0.32%(參見表3)，紫蘇醛含量從高到低依次是：c4z、c4l、b2、r1、b3、z2、f1、r2、b6，其中前4個種質的平均含量在0.25%以上。

圖2直觀反映各種質含量的分布狀況，b6、f1、r2、z2含量分布較為集中，且主要在0.2%以下；b3基本以0.2%為中值和集中分布，高低都有分布；b2、c4l、c4z、r1含量分布范圍跨度很大，隨不同的采收時間和植物的不同部位存在較大的變化幅度，而且存在高于0.4%，甚至高于0.6%(b2、c4l、c4z)的情況，說明這4個種質的紫蘇醛合成還強烈地受到生長發育的調控，值得進行深入研究。

圖2 不同種質紫蘇醛含量頻數分布

4.3 不同采樣日期

紫蘇醛含量會隨著生長情況發生變化，各部位在采樣時間上發生的含量變化(見圖3)對于生產實踐的指導更有意義。

圖3 各部位不同采樣日期紫蘇醛含量

圖3顯示，頂部葉在9月21日，出現明顯峰值，之后下降，9月30日達到低谷后，略微回升。含量變化非常顯著。中部葉的變化趨勢和頂部葉類似，在9月21日，出現明顯峰值，之后下降，9月30日達到低谷后，略微回升，單9月21日的峰值不很高，后期的回升幅度和前期的峰值相差不大，也就是9月21日達峰值之后整體含量變化比較小。底部葉在9月30日才達到峰值，之后一直降低。

從生物量的角度來看中部葉>底部葉>頂部葉，中部葉是產量主要貢獻者，中部葉在后期含量相對穩定。因此對于采收來說，或者在開始抽穗時采收，全部采收各種葉片，可以獲得最高含量的紫蘇葉藥材，如該種質同時采收果實，則果實成熟后，采收頂部葉和中部葉片，也可以產出紫蘇醛含量較好的紫蘇葉藥材。

4.4 各種質不同采摘部位

前文的研究證明，種質是對紫蘇醛含量影響最大的主要因素，因此我們考察不同采摘部位紫蘇醛含量變化時，首先把種質也作為區分進行分析(見圖4)。

圖4 各種質不同部位紫蘇醛含量

圖4顯示，各種質基本上紫蘇醛含量在各部位(包括了不同的采摘時間和采樣時期的平均值)的分布情況是頂>中>底，只有r2顯示出中部葉含量高于頂部葉。Yuh-Jyuan Lee[6]的研究也表明紫蘇頂部葉的紫蘇醛含量要高于其它部位。

5 結論

5.1 影響紫蘇醛含量的因素

種質因素是最主要因素，采摘部位和采樣時間次之，一天內的采摘時間影響不大。

9月21日左右出現峰值，隨后有下降和回升現象，推測開花可能影響含量降低，但是通過對較為優良的4個種質的分析發現，達峰時間和紫蘇自身生育期關系并不嚴格對應，開花期或開花期之前會達到峰值，每個特定種質的具體情況還待進一步深入研究。

頂部葉紫蘇醛含量最高，而且變化較大，開花前出現高峰值，之后驟降；中部葉含量顯著低于頂部葉，但是達到峰值后含量較穩定；底部葉的含量達峰時間晚于前兩者，一般出現在花果生長期，隨后一直下降。

迄今研究過紫蘇醛型揮發油成分含量隨生長發育季節變化的研究很少，且使用GC/MS研究組分相對含量的變化[4-5]，但相對含量變化受組分構成的影響，不能反映含量的準確變化。

5.2 對于紫蘇葉采收方式的建議

紫蘇葉藥材根據紫蘇應用途徑不同，采收方式有多種，產出的藥材質量不同。根據本文的研究結果，開花期前采收頂部嫩葉，藥材品質最優；在生長期以不影響植物繼續生長的前提下持續采收中部成熟葉，則質量優良，但多次采收比較費工，適合于需要后續應用其他部位的情況；開花前期采收全部葉，質量中等且不夠均勻，但是產量和成本最低；如以紫蘇果實為生產目標，兼顧蘇葉資源綜合利用，則采收完果實同時采收全部葉，葉中紫蘇醛含量較低，品質較差，可用于提取紫蘇葉揮發油。

[1] 魏長玲，郭寶林.紫蘇葉揮發油的不同化學型及研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40(15)：2937-2944.

[2] 魏長玲，郭寶林，張琛武，等.中國紫蘇資源調查和紫蘇葉揮發油化學型研究[J].中國中藥雜志，2016，43(10)：1824-1834.

[3] 魏長玲.中國紫蘇種質資源調查及紫蘇葉揮發油化學型研究[D].北京協和醫學院，2016.

[4] 魏長玲，張琛武，郭寶林，等.紫蘇葉揮發油化學型和組分影響因素探究I-不同生長發育期[J].中國中藥雜志，2017，42(4)：712-718.

[5] 邵平，洪臺，何晉浙，等.紫蘇精油主要成分季節性變化分析及其干燥方法研究[J].中國食品學報，2012，12(9)：216-221.

[6] Yuh-Jyuan Lee，Chwen-Ming Yang.Seasonal Changes of Growth and Leaf Perillaldehyde inPerillafrutescens(L.)Britton[J].Taiwan Agric.Res，2009，58(2)：114-124.

StudyonChangePatternofPerillaldehydeContentinDifferentGermplasmofPerilla

ZHANGChenwu1，2，LIWeiping1，GUOBaolin1，WEIChangling1

(1.ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030002；2.InstituteofmedicinalplantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193)

Objective：To study the change pattern of perillaldehyde content in perillaldehyde type germplasms.MethodsAn HPLC method for the quick determination of perillaldehyde content was established.Samples ofPerillafrutescensleaves from 9 different germplasms were collected at different dates，locations and times，and perillaldehyde content of the samples was determined.ResultsandConclusionThe average content of perillaldehyde in the 9 perilla germplasms was 0.05%～0.32%，and the average contents of 4 germplasms were above 0.25%.In general the top leaf perillaldehyde content is the highest，and the variety is bigger，highest before flowering，then drop after；middle leaf content is little lower than top leaf，the highest content appears generally before flowering，then relatively stable；the peak content of the bottom leaf occurs in the growth period of flower and fruit，then declining.Different germplasm is not very consistent.Germplasm is the most important factors affecting the content ofPerillafrutescens，and follows by the picking time and sampling date，but the picking time in the same day had little effect.

Perilla frutescens；perillaldehyde；content change；germplasm

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.013

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郭寶林，研究員；研究方向：中藥資源、鑒定、栽培；Tel：(010)57833134，E-mail：guoboalin010@163.com

2017-07-03)