中藥材地龍中七種指示性多氯聯苯殘留量測定研究△

李嘉欣，王鵬思，王玉潔，石上梅，薛健*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.國家藥典委員會，北京 100061)

·基礎研究·

中藥材地龍中七種指示性多氯聯苯殘留量測定研究△

李嘉欣1，王鵬思1，王玉潔1，石上梅2*，薛健1*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.國家藥典委員會，北京 100061)

目的建立動物源性中藥材地龍中持久性有機污染物多氯聯苯殘留量的測定方法。方法對樣品提取方法中的提取溶劑、溶劑用量、提取時間進行正交試驗，對兩種凈化方法(磺化-堿性氧化鋁柱凈化、GPC-堿性氧化鋁柱凈化)的凈化效果進行比較，最終確定樣品用正己烷-丙酮(1∶1)超聲提取，提取液經磺化-堿性氧化鋁柱凈化，正己烷洗脫，氮吹濃縮后經氣相色譜法測定，外標法定量。結果7種指示性多氯聯苯在0.002～7.0 mg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999 0，檢出下限在0.006～0.025 mg·kg-1，定量下限在0.020～0.084 mg·kg-1，回收率在83.8%～105.3%，RSD在3.2%～7.5%。結論本方法簡便、快捷、靈敏度高、準確性好，適用于動物源性中藥材中指示性多氯聯苯殘留量的測定。

地龍；多氯聯苯；氣相色譜法；殘留測定

多氯聯苯(polychlorobiphenyls，PCBs)又稱氯化聯苯，是一類人工合成有機物，是聯苯苯環上的氫原子為氯所取代而形成的一類氯化物，共有209個同系物異構體[1]。多氯聯苯是典型的環境持久性有機污染物，被《斯德哥爾摩公約》規定為優先控制的12種持久性有機污染物之一[2]。據估計，全世界多氯聯苯(PCBs)的總產量約120萬噸，其中約30%已釋放到環境中，60%仍存在于舊電器設備或垃圾填埋場中，并將繼續向環境中釋放[3]。PCBs的理化性質十分穩定，不易分解或降解，可通過一系列的揮發、擴散、對流等過程在空氣、水、土壤等介質中遷移或轉化[4]。PCBs具有低水溶性、高脂溶性的特點，因此易在脂肪組織中溶解，通過不斷的生物富集和食物鏈傳遞進而對人體健康產生威脅，不僅在環境中造成廣泛污染，也對動物和人類的神經、免疫、生殖、內分泌等系統造成較大傷害[5]。盡管20世紀70年代后期各國陸續停止生產和停止使用多氯聯苯PCBs，但其對環境和人體健康的影響依然普遍存在。全球環境監測系統/食品規劃部分(GEMS/FOOD)中規定了7 種“指示性PCB”單體(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180)作為監測多氯聯苯(PCBs)污染情況的指標[6]。我國頒布的GB2762-2012《食品安全國家標準食品中污染物限量》也是以這7種指示性PCBs單體的總和作為指標，并規定水產動物及其制品中PCBs的限量為0.5 mg·kg-1[7]。

地龍(Pheretima)作為我國傳統的動物源性中藥材，其用藥歷史悠久，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功能[8]。現階段，國內外學者對于地龍的研究主要集中在其活性成分及藥理作用的開發，隨著降壓、抗血栓、抗心律失常、抗腫瘤、免疫調節、鎮痛消炎等新功效的不斷發現，其藥用價值越來越受到重視，臨床應用也越發廣泛[9]。然而，對地龍中富含的有害物質的檢測卻鮮有報道。由于地龍喜在富含腐殖質的土壤中生活，導致環境中的一些污染物易在地龍體內蓄積，并以此為源頭在食物鏈中進行轉移，最終影響人類健康，因此有必要對地龍中的環境污染物殘留量進行檢測。目前國內外鮮有報道適用于中藥材中PCBs殘留量的分析方法，已有的該類污染物的殘留檢測方法如GC-ECD、GC-MS、生物分析法和免疫分析法等均是針對于環境、食品類樣品[5，10-13]。因此，本研究以我國傳統中藥材地龍為研究對象，通過對樣品前處理過程中提取方法的正交試驗及凈化方法的比較研究，建立了高效、簡便、高靈敏度的中藥材中PCBs殘留檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

6890N氣相色譜儀(美國Agilent公司)，配電子捕獲檢測器(ECD檢測器)；高純氮氣(純度≥99.999 2%，北京氦普北分氣體工業有限公司)；JSP-750A高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；PL203/01電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TP-150超聲波清洗機(北京天鵬電子新技術有限公司)；80-2離心沉淀器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；Preplinc GPC凝膠滲透色譜儀(美國J2 Scientific公司)；HGC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司)。

1.2 材料

正己烷(色譜純，美國Fisher公司)；丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、環己烷、無水硫酸鈉、硫酸(分析純，北京化工廠)；堿性氧化鋁(100～200目，國藥集團化學試劑有限公司)；多氯聯苯混合標準品(14 mg·L-1，上海安譜科學儀器有限公司)。

隨機從北京市10個藥店收集地龍樣品，樣品分別產自廣西、廣東、上海、河北、山東、北京地區，經中國醫學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為正品。

2 方法

2.1 氣相色譜條件

進樣口溫度：290 ℃，不分流進樣，進樣量：1 μL；檢測器溫度：300 ℃，尾吹氣(氮氣)：60 mL·min-1；DB-5石英毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，恒流模式，柱流量：1.0 mL·min-1；程序升溫(90 ℃保持1 min，20 ℃·min-1速度升至180 ℃，保持1 min，以3 ℃·min-1速度升至300 ℃，保持2 min)，外標法定量。

2.2 標準品溶液的制備

精密量取多氯聯苯混合標準品5 mL于10 mL茶色容量瓶中，用色譜級正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為7 μg·mL-1的7種多氯聯苯混合標準品儲備溶液，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.3 樣品提取方法

地龍樣品粉碎后過60目篩，精密稱取粉碎后樣品2.00 g，轉移至100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL質量濃度為2 mg·mL-1多氯聯苯混合標準品溶液，混勻過夜。加入無水硫酸鈉1 g，按照表1、2的正交試驗設計超聲提取后，將濾液過濾至梨形瓶中。將收集到的濾液于40 ℃水浴中減壓濃縮至近干。將濃縮液用正己烷定量轉移至10 mL具塞刻度試管中，定容至5 mL，凈化后測定其平均回收率，每個處理3個重復。

表1 多氯聯苯殘留量測定提取方法的正交試驗因素水平表

表2 多氯聯苯殘留量測定提取方法的正交試驗表

2.4 樣品凈化方法

2.4.1 磺化-堿性氧化鋁柱凈化 取地龍空白樣品，按上述提取方法制得5 mL提取液后，小心加入含10%水的濃硫酸1 mL，振搖1 min，于3000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液。取1根潔凈的玻璃色譜柱(12 mm×250 mm)，關閉活塞，玻璃柱底端填入少量玻璃棉后，從下向上依次裝入2.5 g活化堿性氧化鋁(660 ℃中活化6 h)、2 g無水硫酸鈉。用30 mL正己烷預淋洗，待液面到達柱面頂部后，將1 mL上清液轉移至色譜柱上，用10 mL正己烷溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL刻度試管中，氮吹至1 mL，待GC分析測定。

2.4.2 GPC-堿性氧化鋁柱凈化 取地龍空白樣品，按上述提取方法制得5 mL提取液后，經凝膠滲透色譜儀進樣，洗脫液為乙酸乙酯-環己烷(1∶1)，流速為5 mL·min-1，收集11～16 min的洗脫液。將1 mL GPC洗脫液加入預先用30 mL正己烷淋洗過的上述堿性氧化鋁柱上，用10 mL正己烷溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL刻度試管中，氮吹至1 mL，待GC分析測定。

3 結果

3.1 色譜行為

取7種多氯聯苯混合標準品溶液2 mg·L-1，按2.1儀器工作條件進行測定，7種多氯聯苯混合標準品的出峰情況見圖1。實驗從被測物質的性質考慮，選用弱極性的DB-5毛細管色譜柱。由圖1可知，在該實驗條件下，各化合物的色譜峰峰形良好，均能達到基線分離，滿足外標法定量要求。

注：1.PCB28；2.PCB52；3.PCB101；4.PCB118；5.PCB153；6.PCB138；7.PCB180。圖1 7種多氯聯苯混合標準品溶液氣相色譜圖

3.2 提取方法的選擇

本研究采用簡單、經典的超聲波提取方法。由于多氯聯苯的極性隨其所含氯原子數的增多而減弱，因此，低氯多氯聯苯則更易被極性溶劑萃取，而高氯多氯聯苯則更易被非極性溶劑萃取。根據待測物的性質，選擇正己烷、正己烷-丙酮(1∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)3種溶劑進行對比。考慮到提取時間及提取溶劑用量對提取結果的影響，對提取溶劑、提取時間、提取溶劑體積3個因素進行了正交試驗，結果見表3。

表3 多氯聯苯殘留量測定提取方法的正交試驗回收率(n=3)

由表3可以看出，在試驗1的條件下，7種多氯聯苯的回收率在82.5%～106.0%，較其他條件回收率好。因此，實驗的提取方式確定為以50 mL正己烷-丙酮(1∶1)作為提取溶劑分兩次進行提取，每次超聲提取30 min。

3.3 凈化方法的選擇

動物性中藥材作為一類生物源性樣品，其所含基質成分較為復雜，對目標分析物的痕量測定有較大干擾，因此需要通過一定的方法對提取液進行處理，去除干擾以保證測定方法的準確性。地龍體內富含蛋白質、脂肪、核苷酸、酶等生物活性成分，因此在進行基質凈化時，主要對這些有機大分子物質進行去除并分離。去除的方法大致可分為兩類：一類是破壞性去除，如濃硫酸磺化法、強堿皂化法等；另一類是非破壞性去除，如凝膠滲透色譜法(GPC)、吸附柱法、透析法、低溫沉降法等。分離常采用色譜柱色譜法，如氧化鋁柱(酸性、中性、堿性)、弗羅里硅土柱、硅膠柱、活性炭柱[14-16]。由于多氯聯苯為對酸穩定的有機鹵素污染物，因此本研究比較了常用的破壞性磺化法與非破壞性凝膠滲透色譜法，并結合堿性氧化鋁柱進一步凈化，將基質的去除與分離相結合，確定了適用于地龍基質的凈化方法。

堿性氧化鋁柱一般使用正己烷作為洗脫劑，通過測定多氯聯苯混合標準品溶液的流出曲線，考察其在堿性氧化鋁柱上的洗脫行為。結果表明在0～5 mL和5～10 mL均有標準品溶液流出，10 mL后不再流出，故洗脫劑正己烷的體積為10 mL。同樣對GPC的洗脫行為進行考察，結果表明前11 min內無標準品溶液流出，11～16 min有標準品溶液流出，16 min后不再流出，故洗脫劑收集時間為11～16 min。空白樣品通過兩種不同凈化方法的凈化效果如圖2所示。

注：A.磺化-堿性氧化鋁柱凈化法；B.GPC-堿性氧化鋁柱凈化法。圖2 不同凈化方法下空白樣品溶液凈化后的色譜圖

從圖2中可以看出，在多氯聯苯混合標準溶液流出的10～30 min內，磺化-堿性氧化鋁柱比GPC-堿性氧化鋁柱的凈化效果好，凈化后的空白樣品基質干擾峰較少。由此可見，GPC對于地龍基質而言并不適用。因此，實驗的凈化方法確定為磺化-堿性氧化鋁柱凈化法。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系及檢出下限 將多氯聯苯混合標準溶液分別配制成質量濃度為0.002、0.02、0.2、1、2、3.5、7 mg·L-1的系列標準工作溶液，進樣量1 μL，在確定的色譜條件下進行測定。以試樣濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行回歸計算，各PCB的線性方程和相關系數結果見表4。結果顯示，各PCB在質量濃度0.002～7.0 mg·L-1的范圍內，r均大于0.999 0，線性關系良好。根據標準品溶液在儀器中的檢出濃度，對加標空白樣品經處理后測定信噪比，以信噪比(S/N)為3測得方法的檢出下限(LOD)；以信噪比(S/N)為10測得方法的定量下限(LOQ)。結果顯示，PCBs的檢出限在0.006～0.025 mg·kg-1，定量下限在0.020～0.084 mg·kg-1。

表4 各PCB線性方程和相關系數

3.4.2 準確度和精密度 準確稱取地龍樣品2.00 g，分別精密添加多氯聯苯混合標準品溶液，得到0.2、2.0、3.5 mg·kg-1多氯聯苯添加樣品，按照實驗確定的操作進行提取、凈化，重復3次，7種PCB在不同添加濃度下的回收率和精密度結果見表5。測定結果顯示7種PCB在3個添加濃度下的回收率在83.8%～105.3%，相對標準偏差在3.2%～7.5%，PCB混合標準品溶液與添加樣品溶液色譜圖見圖3。

表5 地龍中PCBs的回收率及精密度(n=3)

注：A.2 mg·L-1多氯聯苯混合標準品溶液；B.2 mg·kg-1空白地龍添加樣品溶液。圖3 多氯聯苯混合標準品與空白地龍添加樣品溶液色譜圖

3.5 樣品測定

經過以上實驗，本研究最終確定的分析方法為：地龍樣品粉碎后過60目篩，精密稱取粉碎后樣品2.00 g，轉移至100 mL具塞三角瓶中。加入無水硫酸鈉1 g，再加入正己烷-丙酮(1∶1)30 mL 超聲提取30 min，靜置，過濾。樣品殘渣再用正己烷-丙酮(1∶1)20 mL重復提取1次，靜置，過濾，合并所有濾液于梨形瓶中。將收集到的濾液于40 ℃水浴減壓濃縮至近干。將濃縮液用正己烷定量轉移至10 mL具塞刻度試管中，定容至5 mL。小心加入含10%水的濃硫酸1 mL，振搖1 min，于3000 r·min-1條件下離心10 min。取上清液1 mL，加入預先用30 mL正己烷淋洗過的堿性氧化鋁柱上。用10 mL正己烷溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL刻度試管中，氮吹至1 mL，即得。

按照本實驗確定的方法對收集樣品進行測定，結果顯示各樣品中均未檢出PCBs殘留。

4 結論

本研究建立的中藥材地龍中7種指示性PCBs殘留量的氣相色譜測定方法，在選定的色譜條件下，各PCBs的分離效果較好。樣品前處理方法簡便快捷、成本較低，既能使目標分析物提取完全，又不受干擾物質的影響。本方法的檢出下限遠遠低于食品安全國家標準對PCBs的限量標準，靈敏度較高，準確度和精密度均能達到分析要求，可適用于中藥材中污染物的監督檢測。

此外，由于本研究檢測的樣品量較少、樣品采集地域較為局限，還需進行更大范圍的普查與檢測，從而全面準確的對其質量進行評價。

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StudyonDeterminationofResiduesof7IndicativePolychlorobiphenylsinTraditionalChineseMedicinePheretima

LIJiaxin1，WANGPengsi1，WANGYujie1，SHIShangmei2*，XUEJian1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.ChinesePharmacopoeiaCommission，Beijing100061，China)

Objective：To develop a method for the determination of residues of persistent organic pollutants polychlorobiphenyls (PCBs) in Pheretima derived from traditional Chinese medicine of animal origin.MethodsOrthogonal experimental design was carried out on the extraction solvent，dosage of solvent and extraction time in the sample extraction method.The purification effect of two kinds of purification methods：sulfonation-basic alumina column purification and GPC-basic alumina column purification were compared.The method was determined as follows: sample was extracted ultrasonically with n-hexane and acetone (1∶1), the extract obtained was purified by sulfonation-basic alumina column and eluted by n-hexane, the eluant was concentrated by nitrogen blowing instrument, and finally the concentrate was determined by gas chromatography and quantified by external standard method.ResultsGood linearity was obtained when the concentration of 7 indicative polychlorobiphenyls were within 0.002-7.0 mg·L-1，the correlation coefficients (r) were all greater than 0.999 0.The limit of detection and the limit of qualification were among 0.006-0.025 mg·kg-1and 0.020-0.084 mg·kg-1，respectively.The recoveries were in the range of 83.8%-105.3%，with the relative standard deviation (RSD) among 3.2%-7.5%.ConclusionThis method is simple，rapid，sensitive and accurate，which is suitable for the determination of residues of indicative polychlorobiphenyls in traditional Chinese medicine of animal origin.

Pheretima；polychlorobiphenyls (PCBs)；gas chromatography；residue determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.010

國家重大新藥創制專項(2009ZX09502-027)

*

石上梅，主任藥師，研究方向：中藥質量標準研究，E-mail：ssm@chp.org.cn；薛健，研究員，研究方向：中藥有效成分分析及質量控制、中藥有害物質研究，E-mail：jxue@implad.ac.cn

2017-06-15)