基于指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析評價(jià)山楂葉質(zhì)量差異性△

王領(lǐng)弟，臧亞茹，潘偉東，高婧，杜義龍，潘海峰*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 承德 067000；2.航天中心醫(yī)院 臨床藥理室，北京 100049；3.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

·基礎(chǔ)研究·

基于指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析評價(jià)山楂葉質(zhì)量差異性△

王領(lǐng)弟1，臧亞茹1，潘偉東2，高婧3，杜義龍3，潘海峰3*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 承德 067000；2.航天中心醫(yī)院 臨床藥理室，北京 100049；3.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

目的建立山楂葉藥材波長變換法HPLC指紋圖譜，并用多元統(tǒng)計(jì)分析評價(jià)山楂葉的差異性。方法采用色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18；流動(dòng)相為0.5%甲酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)-四氫呋喃(D)混合溶液，梯度洗脫；檢測波長為0～15 min，檢測波長為260 nm，參比波長為360 nm；15～65 min，檢測波長為370 nm，參比波長為430 nm。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A 版)》軟件中進(jìn)行相似度評價(jià)，并用SPSS 19.0進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，根據(jù)主成分分析結(jié)果再進(jìn)行聚類分析，篩選出可能影響山楂葉藥材差異的指標(biāo)性成分。結(jié)果山楂葉經(jīng)聚類分析分為三大類，初步確定了山楂葉差異的8個(gè)指標(biāo)性成分。結(jié)論本方法快速、準(zhǔn)確，適用于山楂葉差異性的評價(jià)。

山楂葉；指紋圖譜；主成分分析；聚類分析

山楂葉為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥葉[1]，主產(chǎn)于河北、山東、河南、山西、廣西、遼寧等地[2-3]，主要含有黃酮、有機(jī)酸、微量元素、含氮化合物等類成分[4-6]，其中黃酮類是山楂葉生理活性的主要成分[7-9]，臨床上主要用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴和高脂血癥[1]。

目前對山楂葉的研究多為單一波長[10-11]，且化學(xué)成分的研究多采用分光光度法、高效液相色譜法等對單一或多個(gè)成分進(jìn)行定性或定量測定[12-14]，沒有對山楂葉藥材質(zhì)量差異的相關(guān)性成分的研究。隨著現(xiàn)代數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析已用于中藥材的質(zhì)量評價(jià)[15]。本課題組前期對山楂葉進(jìn)行了多組分含量測定[16-17]和指紋圖譜研究[18-19]，本文進(jìn)一步采用波長變換法建立山楂葉指紋圖譜，并進(jìn)行聚類和主成分分析，根據(jù)主成分分析結(jié)果再進(jìn)行聚類分析驗(yàn)證，篩選出可能對山楂葉藥材質(zhì)量有影響的指標(biāo)性成分，從而為山楂葉的全面評價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(二元泵、二極管陣列檢測器)；Agilent Chemstation色譜工作站(美國安捷倫)；HC-2062高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；AG-245型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 材料

對照品牡荊素鼠李糖苷(批號：151024，純度>98%)，和牡荊素葡萄糖苷(批號：151103，純度>98%)購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；對照品牡荊素(批號：111687-200602)、金絲桃苷(批號：111521-201004)、蘆丁(批號：100080-200707)、綠原酸(批號：110753-200413)和槲皮素(批號：100081-200907)，購自中國食品檢定研究院，純度均>99%。甲醇、乙腈為色譜純(Fisher Scientific，USA)，四氫呋喃為色譜純(Mreda Technology Inc，USA)；水為娃哈哈純凈水(河北省高碑店市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū))；其他試劑為分析純。

藥材：18批山楂葉藥材由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科植物山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥葉，樣品編號及產(chǎn)地分別為：S1產(chǎn)地為四川，S2～S7產(chǎn)地為遼寧，S8～S9產(chǎn)地為山西，S10產(chǎn)地為河南，S11～S14產(chǎn)地為河北，S15～S18產(chǎn)地為山東。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.5%甲酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)-四氫呋喃(D)，梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長：0～15 min，檢測波長為260 nm，參比波長為360 nm；15～65 min，檢測波長為370 nm，參比波長為430 nm；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序 %

2.2 溶液制備

對照品溶液制備：精密稱取各對照品適量，用甲醇制成每1 mL含牡荊素葡萄糖苷0.60 mg、牡荊素鼠李糖苷1.00 mg、牡荊素0.3 mg、蘆丁0.08 mg、金絲桃苷0.3 mg、綠原酸0.4 mg、槲皮素0.04 mg的混合對照品溶液，備用。

供試品溶液的制備：將山楂葉去除雜物后，于烘箱內(nèi)60 ℃干燥至恒重(約3 h)，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，取山楂葉細(xì)粉約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入80%甲醇水提取6 h，蒸干，用甲醇水復(fù)溶于10 mL容量瓶中，離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 山楂葉指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1精密度試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)下方法制備編號為S1的山楂葉供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，考察各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果相對保留時(shí)間的RSD<1.2%，相對峰面積的RSD<1.5%，表明精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號為S1的山楂葉，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對保留時(shí)間的RSD<1.5%，相對峰面積的RSD<1.8%，表明重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號為S1的山楂葉，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對保留時(shí)間的RSD <1.6%，相對峰面積的RSD<2.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 山楂葉指紋圖譜及相似度的評價(jià)結(jié)果

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)以中位數(shù)法生成其對照圖譜，設(shè)定S1為參照圖譜，采用平均數(shù)法，將其他樣品的色譜峰與參照圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，共標(biāo)定出10個(gè)共有峰，以9號峰金絲桃苷為參照峰，分別計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。經(jīng)與對照品比對，共指認(rèn)出7個(gè)色譜峰，色譜圖見圖1、2和3。S1～S18批山楂葉的相似度結(jié)果分別為0.938、0.985、0.987、0.982、0.984、0.981、0.982、0.986、0.982、0.836、0.991、0.994、0.997、0.992、0.990、0.998、0.995、0.998。相似度結(jié)果表明，18批山楂葉的相似度存在一定的差異，S10河南產(chǎn)山楂葉相似度匹配結(jié)果較低，S1～S9相似度在0.938～0.987，S11～S18相似度均在0.990以上，需要做進(jìn)一步的多元統(tǒng)計(jì)分析以探究不同產(chǎn)地山楂葉差異的原因。

注：1.綠原酸；2.牡荊素葡萄糖苷；3.牡荊素鼠李糖苷；4.蘆丁；5.牡荊素；6.金絲桃苷；7.槲皮素。圖1 混合對照品溶液色譜圖

圖2 18批山楂葉HPLC疊加色譜圖

注：1.綠原酸；2.牡荊素葡萄糖苷；4.牡荊素鼠李糖苷；6.蘆丁；8.牡荊素；9.金絲桃苷；10.槲皮素。圖3 山楂葉指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 聚類分析 系統(tǒng)聚類分析是根據(jù)事物本身的特征研究個(gè)體分類的模式識別方法[20]。對18批山楂葉進(jìn)行指紋圖譜分析后共標(biāo)定出10個(gè)共有峰，以10個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 19.0軟件以平方Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接的方法對18批山楂葉樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。當(dāng)類間距介于5～10時(shí)18批樣品被分為三大類，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9聚為第Ⅰ類，S10為第Ⅱ類，S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17和S18為第Ⅲ類。聚類分析結(jié)果與樣品相似度評價(jià)結(jié)果基本一致，二者可相互印證。

圖4 山楂葉聚類分析的樹狀圖

2.4.2 主成分分析 主成分分析主要是利用降維的思想，從多個(gè)變量間的聯(lián)系入手，將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)但能反映原始變量信息的統(tǒng)計(jì)分析方法，在指紋圖譜研究中有簡明、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[21]。本研究以10個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，首先對共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率、初始因子載荷矩陣，得到主成分得分平面圖，見圖5。

圖5 山楂葉主成分分析得分平面圖

由主成分的貢獻(xiàn)率可知，主成分1的貢獻(xiàn)率最大為63.492%，主成分2的貢獻(xiàn)率為22.411%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上，即前2個(gè)主成分能解釋原變量信息的85%以上，系統(tǒng)自動(dòng)提取前2個(gè)特征值大于1的主成分，可用這2個(gè)主成分新變量代替原有的10個(gè)變量。

初始因子載荷矩陣中的數(shù)據(jù)除以主成分對應(yīng)的特征值開平方根便得到2個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)對應(yīng)的系數(shù)。經(jīng)計(jì)算得出2個(gè)主成分的表達(dá)式為：

F1=0.018X1+0.363X2+0.334X3+0.377X4+
0.256X5+0.239X6+0.355X7+0.346X8+
0.336X9+0.365X10

(1)

F2=0.617X1+0.158X2-0.116X3-0.184X4-
0.37X5+0.459X6+0.218X7-0.259X8+
0.257X9-0.136X10

(2)

由表達(dá)式可知，貢獻(xiàn)率最大的主成分1中系數(shù)較大的為X2、X4、X7、X8、X9、X10，主成分2中系數(shù)較大的為X1和X6，說明峰1、2、4、6、7、8、9、10的量是影響山楂葉差異的主要成分。以這8個(gè)峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS19.0軟件以平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接的方法再次進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9聚為一類，S10為一類，S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17和S18為一類，經(jīng)主成分分析結(jié)果篩選出的數(shù)據(jù)再進(jìn)行聚類分析，與之前聚類分析結(jié)果基本一致，由此得出，通過多元統(tǒng)計(jì)分析可初步篩選出山楂葉的差異指標(biāo)性成分，分別為1號峰(綠原酸)、2號峰(牡荊素葡萄糖苷)、4號峰(牡荊素鼠李糖苷)、6號峰(蘆丁)、7號峰(未知)、8號峰(牡荊素)、9號峰(金絲桃苷)和10號峰(槲皮素)。

圖6 山楂葉經(jīng)過主成分分析后的聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對水-甲醇、水-乙腈、甲酸水-乙腈、甲酸水-乙腈-四氫呋喃、乙酸水-乙腈-四氫呋喃、甲酸水-乙腈-甲醇-四氫呋喃等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了比較篩選，同時(shí)對不同的色譜柱進(jìn)行了試驗(yàn)篩選，結(jié)果以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以0.5%甲酸水-乙腈-甲醇-四氫呋喃為流動(dòng)相，各峰的分離度良好，峰高適中。

由于山楂葉指紋圖譜中有機(jī)酸類先被洗脫，黃酮類后被洗脫，而有機(jī)酸類的檢測波長一般較低，在200～300 nm的居多，黃酮類的檢測波長一般在254 nm或365 nm左右，單一波長紫外檢測無法同時(shí)有效地檢測所有成分，因此為保證指紋圖譜的最大信息量化，本研究采取了波長轉(zhuǎn)換的方式，前15 min檢測波長為260 nm，參比波長為360 nm；后50 min檢測波長為370 nm，參比波長為430 nm。此波長轉(zhuǎn)換法克服了單一波長信息不突出甚至缺失的缺點(diǎn)，最大程度地發(fā)揮了紫外檢測器的檢測效能，有機(jī)酸類和黃酮類成分的特征峰均能很好地顯現(xiàn)出來，響應(yīng)值均較強(qiáng)，能更加全面、真實(shí)地揭示山楂葉的內(nèi)在特征。

3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

目前，對山楂葉藥材的HPLC指紋圖譜已有相關(guān)報(bào)道，但并沒有對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘，沒有找出隱藏在眾多共性下的差異。本研究采用常規(guī)的高效液相色譜法，建立山楂葉的指紋圖譜，標(biāo)定出10個(gè)共有峰，并根據(jù)對照品指認(rèn)出其中7個(gè)，18批山楂葉與對照圖譜匹配相似度存在一定的差異。在相似度評價(jià)的基礎(chǔ)上，本文基于指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對可能影響山楂葉差異的指標(biāo)性成分進(jìn)行了初步篩選，首先通過聚類分析將18批山楂葉藥材分為3大類，與相似度結(jié)果可相互印證。其次，通過主成分分析結(jié)合再聚類找出山楂葉藥材差異的指標(biāo)性成分，分別為1號峰(綠原酸)、2號峰(牡荊素葡萄糖苷)、4號峰(牡荊素鼠李糖苷)、6號峰(蘆丁)、7號峰(未知)、8號峰(牡荊素)、9號峰(金絲桃苷)和10號峰(槲皮素)，能為進(jìn)一步研究差異成分與質(zhì)量的關(guān)系提供參考，同時(shí)也為制訂山楂葉更加合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。其中7號峰為未知成分，還需后續(xù)研究借助液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等手段進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3 不同產(chǎn)地山楂葉質(zhì)量差異性

由于不同種植地點(diǎn)的水土、光照等生長環(huán)境、栽培及采收加工等因素的影響，導(dǎo)致不同產(chǎn)地的中藥材有效成分的種類和含量存在差異，化學(xué)多樣性更加突出。由相似度結(jié)果可知，四川(S1)、遼寧(S2、S3、S4、S5、S6、S7)、山西(S8、S9)產(chǎn)山楂葉樣品相似度較高(大于0.930)，反映上述3個(gè)產(chǎn)地山楂葉質(zhì)量較為接近；河北(S11、S12、S13、S14)、山東(S15、S16、S17、S18)產(chǎn)山楂葉樣品相似度更高(大于0.990)，反映這兩個(gè)產(chǎn)地山楂葉質(zhì)量更為接近；而河南(S10)產(chǎn)山楂葉樣品相似度較低，僅為0.836，與前面幾個(gè)產(chǎn)地山楂葉差異明顯。此結(jié)果同樣可以從聚類分析和主成分分析結(jié)果中得到，因此可以認(rèn)為產(chǎn)地的不同對山楂葉的質(zhì)量有較大影響。

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EvaluationofDifferenceofHawthornLeafQualityBasedonFingerprintCombinedwithMultivariateStatisticalAnalysis

WANGLingdi1，ZANGYaru1，PANWeidong2，GAOJing3，DUYilong3，PANHaifeng3*

(1.DepartmentofPharmacy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.DepartmentofClinicalPharmacology，AerospaceCenterHospital，Beijing100049，China；3.ChengdeMedicalCollege，HebeiKeyLaboratoryofstudyandexploitationofChineseMedicine，Chengde067000，China)

Objective：The HPLC fingerprint of hawthorn leafs was established by wavelength conversion method，and the differences of hawthorn leafs were evaluated by multivariate statistical analysis.MethodsAn Agilent ZORBAX SB-C18column was used，with the mobile phase of 0.5% formic acid (A) - acetonitrile (B) - methanol (C) - tetrahydrofuran (D) by gradient elution，the detection wavelength were：0-15 min，the detection wavelength was 260 nm，the reference wavelength was 360 nm；15-65 min，the detection wavelength was 370 nm，the reference wavelength was 430 nm.The HPLC fingerprints were obtained and evaluated by Similarity Evaluation System for Chromatographic fingerprint of TCM (2004A edition)，and SPSS 19.0 was used to carry out hierarchical cluster analysis and principal component analysis.According to the principal component analysis，another hierarchical cluster analysis was carried out to screen the possible index compositions that influenced the difference between hawthorn leafs.ResultsThe hawthorn leafs were divided into 3 groups by hierarchical cluster analysis，and 8 index compositions of hawthorn leafs were identified.ConclusionThe method is fast and accurate.It is suitable for the evaluation of the difference of hawthorn leafs.

Hawthorn leaf；fingerprint；principal component analysis；hierarchical cluster analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.007

河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(2016190)；承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201601A043)

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潘海峰，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥分析及中藥質(zhì)量評價(jià)；E-mail：phf2301@163.com

2017-04-09)