獨活寄生湯對膝骨關節炎大鼠關節軟骨基質的影響

陳 俊 ，吳廣文 ，黃云梅 ，葉錦霞 ，鄭春松 ，邱建清 ，劉淑如 ，劉獻祥

（1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

獨活寄生湯對膝骨關節炎大鼠關節軟骨基質的影響

陳 俊1，吳廣文1，黃云梅2，葉錦霞2，鄭春松1，邱建清1，劉淑如1，劉獻祥1

（1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

目的 觀察獨活寄生湯對膝骨關節炎（KOA）大鼠軟骨基質的影響，探討獨活寄生湯治療KOA的作用機制。 方法 2月齡清潔級雄性SD大鼠80只，喂養1周后分為正常組20只和造模組60只。造模組分別在第1、4、7天右膝關節腔注射0.2 mL 4%木瓜蛋白酶。成功造模后，造模組分為模型組、治療組和對照組各20只。正常組、模型組按照 10 mL／（kg·d-1）的劑量灌服生理鹽水；治療組按照 9.3 g／（kg·d-1）的劑量灌服獨活寄生湯；對照組按照0.15 g／（kg·d-1）的劑量灌服奧泰靈。2周為1個療程，共治療4個療程。每2個療程后，處死一批動物，腹主動脈采血，ELISA法測定Ⅱ型膠原 C端肽（CTXⅡ）和Ⅱ型膠原C前肽（CPⅡ）；取右側脛骨平臺于4%多聚甲醛中固定、包埋，甲苯胺藍染色觀察糖胺聚糖變化；Masson染色觀察膠原變化。 結果 與正常組比較，模型組糖胺聚糖含量減少，Ⅱ型膠原表達降低，CTXⅡ顯著升高（P＜0.05），CPⅡ顯著降低（P＜0.05）。治療組治療后，糖胺聚糖含量增加，Ⅱ型膠原表達增加，CTXⅡ含量降低（P＜0.05），CPⅡ含量升高（P＜0.05）。 結論 獨活寄生湯可通過抑制軟骨基質主要成分丟失，有效減輕KOA大鼠關節軟骨基質破壞。

膝骨關節炎；軟骨基質；糖胺聚糖；Ⅱ型膠原；獨活寄生湯

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是指關節退行性改變，以致關節軟骨破壞而引起的一種慢性關節疾病。研究［1］發現軟骨基質代謝異常與關節軟骨破壞緊密相關。獨活寄生湯源于唐·孫思邈《備急千金要方》，臨床廣泛用于 OA 的治療，療效顯著［2］，但其作用機制不明。本研究擬通過復制膝骨關節炎（KOA）大鼠模型，從軟骨基質角度探討獨活寄生湯對KOA的干預作用，以期為獨活寄生湯臨床運用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 獨活寄生湯由獨活9 g，桑寄生6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防風 6 g，肉桂 6 g，細辛 6 g，川芎 6 g，當歸 6 g，芍藥 6 g，干地黃 6 g，人參6 g，茯苓6 g，甘草6 g組成，使用時用蒸餾水煎煮，濃縮至濃度為3 g／mL，-20℃保存備用。奧泰靈（鹽酸氨基葡萄糖，香港澳美制藥廠），使用時用蒸餾水配制，濃度為2.269 g／mL，4℃冰箱保存備用。

1.2 實驗動物 80只雄性SD大鼠［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002］。實驗動物處理方法參照《關于善待實驗動物的指導性意見》執行。

1.3 實驗試劑 甲苯胺藍染色液、masson染色試劑盒（石家莊德薩生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原C端肽和Ⅱ型膠原C前肽檢測試劑盒（美國R&D公司）。

1.4 主要儀器 生物組織石蠟包埋機（湖北孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；全自動石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Image-ProPlus多功能真彩色圖象分析管理系統（美國Media Cybernetics公司）；Elx800通用酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組與模型制備 健康2月齡清潔級雄性SD大鼠80只，適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為正常組20只和造模組60只。正常組不做任何處理。造模組在第1、4、7天右膝關節腔注射4%木瓜蛋白酶復制膝骨關節炎模型［3］。造模2周成模后［4］，按隨機數字表法將造模組隨機分為模型組、治療組和對照組各20只。各組大鼠給藥劑量換算參考文獻［5］，正常組、模型組按照 10 mL／（kg·d－1）的劑量灌服0.9%生理鹽水，治療組按照9.3 g／（kg·d－1）的劑量灌服獨活寄生湯，對照組按照 0.15 g／（kg·d－1）的劑量灌服奧泰靈。

2.2 組織取材與處理 治療4周和8周后，分批處死動物，腹主動脈采血，ELISA法測定Ⅱ型膠原C端肽（collagen typeⅡC-telopeptide，CTXⅡ）和Ⅱ型膠原 C 前肽（typeⅡprocollagen C-propeptide，CPⅡ）；取右側脛骨平臺于4%多聚甲醛中固定、包埋，甲苯胺藍染色觀察糖胺聚糖變化；Masson染色觀察膠原變化。

2.3 ELISA法檢測血清中CTXⅡ、CPⅡ含量 具體實驗步驟參照試劑盒說明書。

2.4 糖胺聚糖甲苯胺藍染色 連續治療4周和8周，麻醉成功后，切取右側脛骨平臺于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣8周，進行常規石蠟包埋。石蠟包埋的組織切片常規脫蠟脫水，0.1%甲苯胺藍染色30min，流水沖洗1min，冰醋酸溶液中于顯微鏡下分色數秒；蒸餾水洗2次，各2min；染色后進行乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.5 Masson膠原染色 采用2.4中的組織包埋塊，切片常規脫蠟至水，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色5～10 min；酸性乙醇分化，水洗；Masson藍化液返藍，蒸餾水洗1 min；麗春紅染色液染色5～10 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min；常規乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.6 統計學方法 運用SPSS22.0統計軟件分析。計量資料符合正態分布的以（x±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析；等級資料采用秩和檢驗。

3 結 果

3.1 各組治療后血清CTXⅡ和CPⅡ比較 見圖1。

圖1 各組治療后血清CTXⅡ和CPⅡ比較

3.2 Masson染色 正常組中關節軟骨組織結構清晰，軟骨膠原呈綠色，染色均勻（圖2A、圖2B）。模型組中軟骨膠原染色脫失嚴重，潮線向上升起的火焰狀紅色增多（圖2C），隨著時間推遲，紅色明顯增多（圖2D）。治療組和對照組軟骨綠色脫失減輕，潮線向上升起的火焰狀紅色明顯減少（圖2E、圖2F），提示膠原性質的改變及Ⅱ型膠原減少程度降低［6］；隨著治療時間的延長，紅色進一步降低（圖2G、圖2H），治療組與對照組間無明顯差別。

3.3 甲苯胺藍染色 由圖3A、圖3B可見：正常組中細胞排列整齊、規則，軟骨基質異染呈紫藍色，且染色深、面積大，軟骨下骨染色淺。模型組染色深度和面積均下降，有些部位出現大面積失染（圖3C）；隨著時間的延長，軟骨基質染色的深度和面積進一步降低；細胞排列紊亂、不規則（圖3D）。治療組治療后，染色深度和面積均明顯提高，細胞排列較模型組規則（圖3E）；隨著治療時間的延長，染色深度和面積進一步提高（圖3F）。對照組治療后，染色深度和面積明顯提高，細胞排列較模型組規則，與治療組比較，無明顯差別（圖3G、圖3H）。

圖3 各組脛骨切片甲苯胺藍染色圖（×200）

4 討 論

OA基本病理改變是多種致病因素引起進行性關節軟骨變性、破壞，其中，關節軟骨基質破壞將導致軟骨降解，最終造成關節軟骨的破壞［7］。軟骨基質由軟骨細胞合成并分泌，主要由Ⅱ型膠原和蛋白多糖組成［8］。在骨關節炎中，軟骨細胞合成和分泌Ⅱ型膠原能力降低，但合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原能力提高［9］。Masson染色方法可顯示軟骨膠原的改變，正常關節軟骨系Ⅱ型膠原，呈藍綠色，鈣化軟骨和軟骨系Ⅰ型膠原呈紅色，OA關節軟骨從潮線向上升起很多火焰狀紅色。本研究提示獨活寄生湯和奧泰靈治療OA具有一定的時間依賴。

當前，許多學者也采用生物標記物來評估骨關節炎軟骨損傷程度，而在已知的標記物中，Ⅱ型膠原（collagen typeⅡ）是評價骨關節炎的重要標志物，CTXⅡ和CPⅡ作為Ⅱ型膠原降解、合成標志物，其變化可反映軟骨損傷程度［10］。本研究進一步證實獨活寄生湯和奧泰靈均可抑制Ⅱ型膠原的降解、促進其合成，從而減緩軟骨退變。但治療組和對照組同期比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

甲苯胺藍可將軟骨基質中的糖胺聚糖異染呈紫藍色，其機制是甲苯胺藍陽離子與酸性基團結合，導致吸收光譜改變。本研究表明獨活寄生湯和奧泰靈均可以促進軟骨細胞分泌糖胺聚糖，促進損傷軟骨的修復，2組療效無明顯差別。

綜上可知，獨活寄生湯可抑制軟骨基質主要成分Ⅱ型膠原和蛋白多糖的丟失，有效減輕膝骨關節炎大鼠關節軟骨基質破壞，對關節軟骨具有一定的保護作用，

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0024-03

2017-10-08

國家自然科學基金資助項目（81573801）；福建省自然科學基金杰青項目（2017J06018）；2017年度福建省中醫藥科技項目（2017FJZYJC204）

陳俊（1986—），女，醫學碩士，講師，主要從事中西醫結合防治骨關節炎研究。

劉獻祥（1963—），男，教授，博士生導師。E-mail：liuxianxiang@163.com