一株薄荷抑菌內生菌鑒定與抑菌活性分析

張艷翠++謝秋姣++朱衛平++陳東紅

摘要 從薄荷里篩選出一株具有抑菌活性的內生細菌（命名為BH2），通過對菌株進行形態學觀察和16S rDNA序列分析，表明該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌。抑菌試驗結果表明，該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、未知霉菌均有抑菌活性。

關鍵詞 薄荷；內生細菌；解淀粉芽孢桿菌；抑菌活性

中圖分類號 S681.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）17-0068-02

Abstract An endophytic bacterium named BH2 with antibiotic activity from Mentha haplocalx Briq was screened.Morphological observation and 16S rDNA sequence analysis indicated that BH2 belong to Bacillus amyloliquefaciens.Antimicrobial experiments showed BH2 can inhibit the growth of Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus and an unknown fungus.

Key words Mentha haplocalx Briq；endophytic bacterium；Bacillus amyloliquefaciens；antibiotic activity

薄荷（Mentha haplocalx Briq）為唇形科一年生藥食兩用植物，其揮發油經加工后得到的薄荷腦等被廣泛地應用于醫藥、食品、化妝品、香料、煙草等工業，具有巨大的經濟價值[1]。最近研究發現，薄荷對治療癌癥有特殊功效，薄荷油還具有一定的抗菌活性，其內生真菌在長期的進化中通過基因交流，代謝產物也具備一定的抑菌效果，作為生物抑菌劑具有巨大的開發潛力。

植物內生細菌（endophyte）是指定殖在健康植物組織內，并與植物建立和諧聯合關系的一類微生物[2]。隨著對其深入的研究，國內外一些學者發現，定殖后的內生細菌可起固氮作用，可分泌植物促生物質，對病蟲害起生防作用。引起了微生物學家、生態學家、植病學家的廣泛興趣，近年來成為國內外研究的熱點之一[3]。自1993年以來，人們從多種藥用植物中陸續分離出產生活性物質的內生菌，藥用植物內生菌已成為人們尋找新型骨架化合物藥物的重要來源，并具有不可替代的優勢[4]。

近幾年，國內外對薄荷內生菌的研究主要是內生真菌方面，集中研究的有薄荷內生真菌的多樣性及組分的分析、內生真菌對薄荷自身生長、揮發油、精油的影響以及生物防治作用等[5]。此外，薄荷內生細菌僅僅在種類多樣性的探究，在生物防治方面的研究很少，而生物防治與人類生活、健康及環境保護息息相關[6]。細菌較真菌繁殖周期短，實驗周期短，若能篩選出抑菌性較好的薄荷內生細菌，分離其代謝產物和次生代謝產物，并對活性物質進行篩選鑒定，可能在生物防治方面會有一定的突破。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

薄荷采自湖南農業大學校園內。抑菌試驗用敏感指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus sub-tilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、未知霉菌。培養基：LB固體培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生菌的分離與純化。按常規的無菌操作方法，用組織分離法取薄荷新鮮葉及幼嫩莖，按下列程序表面消毒：自來水沖洗后先后經70%酒精漂洗30 s，0.6%過氧化鈉漂洗5 min，無菌水沖洗3～5次。將經過處理的樣品在無菌條件下切割成小塊，接種于PDA固體培養基上；一部分切割的小塊在滅菌的研缽中進行研磨并加1 mL水混勻，取適量于LB培養基中并涂布均勻。每種培養基設3個平行組，以最后一次清洗無菌水作對照，于28 ℃溫箱倒置培養1周。

1.2.2 抑菌性內生菌的篩選。①平板對峙培養法。針對指示菌為病原菌，吸取病原菌菌液200 μL于LB固體培養基平板中心，吸取200 μL待測菌液于其周圍同等距離處點3 處，于28 ℃恒溫倒置培養，待菌落長滿后觀察抑菌效果。②濾紙片法。指示菌與無菌水1∶100混合后取200 μL于LB固體培養基中涂勻。將BH2菌株發酵液在4 ℃下以6 000 r/min離心20 min，保留上清，用60%硫酸銨沉淀4 h后，在4 ℃下以8 000 r/min離心20 min，無菌細菌過濾器進行過濾。取過濾液，用直徑6 mm的無菌濾紙浸濕，并置于平板上，28 ℃恒溫倒置培養，待菌落長滿后觀察。

1.2.3 內生菌細菌的鑒定。①形態學分析。將篩選具有較強抑菌性的菌株接種到YEB培養基平板上，于28 ℃培養24 h，觀察菌落形態及細胞形態。細胞形態采用革蘭氏染色進行觀察。②16S rDNA基因的系統發育分析。用CTAB法提取BH2基因組總DNA。根據細菌16S rDNA通用引物，以基因組DNA作為模板進行PCR擴增，產物經純化后，送公司測序?；?6S rDNA基因序列的聚類分析，利用在線BLAST軟件在NCBI GenBank數據庫中進行比對；選取同源性高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對象，采用Clustal X軟件進行多序列比對，然后利用MEGA6軟件中的鄰接法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 薄荷內生菌的分離及抑菌測試

從薄荷莖、嫩葉中采用表面消毒方法分離內生細菌，共分離出16株內生細菌，分別命名為BH1～BH11。通過平板對峙試驗，篩選出1株可產生光譜抗性物質的的內生菌BH2。其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌以及未知霉菌均有不同程度的拮抗作用。通過對其發酵液進行硫酸銨沉淀處理后進行抑菌測試，確定抑菌物質存在于上清液中（圖1）。

2.2 BH2菌株的鑒定

2.2.1 內生菌的形態學觀察。在LB培養基上生長24 h，BH2菌落呈現為白色，不透明，邊緣不規則。顯微鏡觀察顯示菌體為短桿狀，有芽孢，為革蘭氏陽性菌（圖1）。

2.2.2 16S rDNA 分子鑒定。利用 16S rDNA通用引物進行PCR擴增并測序，得到菌株BH2的DNA序列，通過NCBI在線BLAST程序進行同源比對搜索發現，BH2的16S rDNA 序列與已公布的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） 具有99%的同源性。然后通過Clustal X1.83和MEGA6軟件采用鄰接法構建系統進化樹進一步確定 BH2與B.amylo-liquefaciens的親緣關系最近（圖2）。綜合判定內生菌 BH2為解淀粉芽孢桿菌的一個亞種，故命名為B.amyloliquefacie-ns BH2。

3 結論與討論

薄荷具有重要的藥理價值，其富含揮發性的薄荷油成分，可用于清涼止癢、發汗解熱、促透作用、抗早孕、抗著床、抗真菌、抗病毒等；另外，其非揮發性成分可發揮保肝利膽抗腫瘤、烏發、抗氧化等功效[7]。內生菌在與宿主之間長期協同進化的過程中，經常會與宿主之間發生基因的平行轉移，從而可能獲取部分宿主的特性甚至參與宿主的次生代謝過程。因此，對薄荷內生菌進行分離和研究，希望能發現新的內生菌資源，并開發出潛在的新的活性代謝物。本研究從薄荷中分離到一株內生菌BH2，形態學和分子鑒定表明，BH2屬于一種新的解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌作為生防細菌的研究比較多，其能產生多種不同類型的抗菌物質，如抗菌蛋白、伊枯草菌素、幾丁質酶等，在植物病蟲害防治方面貢獻突出[8]。內生菌BH2對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、霉菌的生長具有顯著的抑制作用；但其合成的水溶性抗菌活性成分及相應的生物學功能，仍需進一步深入探討。

4 參考文獻

[1] 郭曉恒，劉濤，宋登敏，等.亞洲薄荷內生真菌多樣性研究[J].廣東農業科學，2013，40（16）：32-34.

[2] KLOEPPER J M.BEAUCHAMP C J.A review of issues related to measu-ring colonization of plant roots by bacteria[J].Can J MICROBIOL，1992，38（12）：1219-1232.

[3] 苗則彥，趙奎華，劉長遠，等.我國植物內生細菌對病蟲害防治研究現狀[J].遼寧農業科學，2003（6）：31-32.

[4] 李東旭，李軍，鄧振山.薄荷中內生真菌的篩選和初步研究[J].安徽農業科學，2008，36（23）：10011-10012.

[5] 梁越，劉洋，田兆豐，等.薄荷根內生及根際細菌多樣性探究[J].生物技術通報，2010（10）：104-115.

[6] 陳澤斌，李冰，王定康，等.薄荷內生細菌的多樣性及組成分析[J].浙江農業學報，2016，28（1）：56-63.

[7] 沈梅芳，李小萌，單琪媛.薄荷化學成分與藥理作用研究新進展[J].中華中醫藥學刊，2012（7）：1484-1487.

[8] 車曉曦，李校堃.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的研究進展[J].北京農業，2010（3）：7-10.