圣露丸的抗結核作用初步實驗研究

王彬 付雷 徐建 郭少晨 朱慧 陸宇

·論著·

圣露丸的抗結核作用初步實驗研究

王彬 付雷 徐建 郭少晨 朱慧 陸宇

目的評價中藥圣露丸的體外及小鼠結核病模型中的抗結核活性。方法在7H9液體培養基、7H10固體培養基中分別測定圣露丸對結核分枝桿菌標準株H37Rv的最低抑菌濃度(MIC)。氣溶膠感染方式采用結核分枝桿菌標準株H37Rv先后感染SPF級BALB/C小鼠46只和36只，分別建立小鼠急性結核病模型。均為感染第10天開始給予藥物治療，隨機分組，每組10只。其中圣露丸組每只小鼠每次劑量為3 g/kg；異煙肼(INH)組，每次劑量為25 mg/kg，同時設無藥空白對照組。各組均口服灌胃給藥，每周給藥5次，分別給予3周和6周藥物治療。治療結束后次日處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數。結果圣露丸在7H9液體培養基中對H37Rv的MIC為2.5 mg/ml，在7H10固體培養基中對H37Rv的MIC為<5 mg/ml。小鼠感染及治療過程中各組耐受性良好，無死亡。給予3周共計15次(每次給予“圣露丸”3 g/kg)劑量治療后，圣露丸組小鼠全肺的CFU為 (6.81±0.71) lg CFU，較空白對照組降低0.39 lg CFU。應用圣露丸治療6周后，圣露丸組的小鼠全肺的CFU為 (4.33±0.51) lg CFU，較空白對照組降低1.10 lg CFU。結論在本研究條件建立的小鼠結核病模型中，中藥圣露丸顯示出抗結核活性，值得進一步研究。

分枝桿菌,結核； 中草藥； 治療結果； 對比研究； 圣露丸

結核病是一種由結核分枝桿菌引起的嚴重危害人類健康的傳染病，隨著耐藥結核病患者的增加，現有抗結核藥物越來越無法滿足臨床治療的需求。新型抗結核藥物的研發迫在眉睫，然而抗結核新藥研發周期長、難度大，自20世紀60年代利福平上市的50年來，僅2個具有全新結構全新機制的抗耐藥結核病新藥分別于2012年、2014年獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準有條件地上市。新藥研制艱難，對傳統中醫藥的研究成為解決結核病防治問題的重要途徑之一。

中醫藥是祖國的寶庫，中藥治療的優勢是多成分、多靶點、多系統、低毒性地發揮綜合作用。中藥雖然不能治愈結核病，但在輔助治療、降低不良反應發生及克服耐藥性等方面發揮重要作用，所以有必要對我國中醫藥進行抗結核作用的評價，以發現其在抗結核治療中的作用和價值。本研究旨在通過體外測試及動物模型評價“圣露丸”的抗結核感染作用。

材料和方法

1.藥物:受試中藥“圣露丸”原粉由吉林省延邊神圣制藥有限公司提供，對照藥異煙肼(INH)為Sigma公司(美國)產品。

2.實驗菌株：結核分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC27294)為北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存的菌株。

3.動物： SPF級雄性BALB/C小鼠，體質量18～20 g/只，飼養在為感染動物模型設計的有空調的房間，每籠不超過6只小鼠，溫度在(21±2) ℃,濕度(55±15)%，保持12 h燈光/12 h黑暗的循環，動物可以方便地獲取食物和經過濾的水。實驗開始前使動物適應環境1周。實驗開始前獲得動物倫理學委員會批準。

4.最低抑菌濃度(MIC)的測定[1]：中藥圣露丸原粉和INH分別用蒸餾水溶解制成初溶液(儲備液)，滅菌后，使其在培養基中為所設計的以下濃度：中藥圣露丸終濃度為10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 mg/ml；INH終濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μg/ml。選取結核分枝桿菌H37Rv標準株培養2～3周的培養物制成菌懸液，接種到含0.05%吐溫-80、10%ADC(白蛋白、右旋糖、過氧化氫酶混合物)營養添加劑的7H9培養基中，37 ℃靜止培養1～2周，生長至濁度為McFarland 1[相當于107菌落形成單位(CFU)/ml]時稀釋并分別接種到含藥的7H9液體培養基(含10%ADC)和7H10固體培養[含10%OADC(氯化鈉、牛血清白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶、油酸混和物)營養添加劑]中，菌液的終濃度為106CFU/ml。實驗分別設無藥對照，置37 ℃培養，以培養4周未見結核分枝桿菌生長的濃度為藥物的MIC。

5.小鼠藥物治療3周急性結核病模型的建立[2]：融化凍存的菌液，用含0.01%吐溫-80(在無菌條件下過濾除菌)的無熱原0.9% NaCl滅菌水稀釋至濃度為106CFU/mL，超聲波處理2 min以分散菌落。活菌計數采用含10%OADC(美國BD公司,BBLTMMiddlebrook OADC Enrichment,Cat.No.212240)的Middlebrook 7H10瓊脂培養基(美國BD公司,DifcoTMMiddlebrook 7H10 Agar Cat.No.262710)，接種系列稀釋度的菌液。按照氣溶膠感染裝置(099C A4224 Inhalation Exposure System)的標準操作規程將結核分枝桿菌標準株H37Rv感染小鼠46只，感染劑量50～100 CFU/只。成功感染后第3、10天分別處死3只小鼠，做肺組織活菌計數。感染第10天開始給予藥物治療，采用數字表法隨機分為4組：(1)受試藥物組給予“圣露丸”3 g/kg(每天1次)(簡稱“圣露丸組”)；(2)陽性對照藥利福平(RFP，美國Sigma公司)組(簡稱“RFP組”)，給予RFP 10 mg/kg(每天1次)；(3)陽性對照藥異煙肼(INH，美國Sigma公司生產)組(簡稱“INH組”)，給予25 mg/kg(每天1次)；(4)無藥空白對照組：每天給予0.5%羧甲基纖維素(CMC)。每組10只，各組均口服灌胃給藥，每周給藥5次，給藥3周共15次。給藥3周停藥，停藥后次日，處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數。

6.小鼠藥物治療6周急性結核病模型的建立：按照氣溶膠感染裝置(099C A4224 Inhalation Exposure System)的標準操作規程感染36只小鼠結核分枝桿菌標準株H37Rv，感染劑量50～100 CFU/只。感染后第3天、第10天分別處死3只小鼠，做肺組織活菌計數。感染第10天開始給予藥物治療：(1)圣露丸組每次給予“圣露丸”3 g/kg；(2)INH 組每次給予25 mg/kg；(3)無藥空白對照組每次給予0.5%CMC。每組10只，均口服灌胃給藥，每周給藥5次，給藥6周共30次。停藥次日處死各組小鼠，稱重，無菌操作下解剖，做肺組織活菌計數。

結 果

1.體外MIC結果：圣露丸在7H9液體培養基中，對H37Rv的MIC為2.5 mg/ml；在7H10固體培養基中，對H37Rv的MIC為<5 mg/ml。詳見表1。

表1 圣露丸與INH在不同培養基中對結核分枝桿菌H37Rv的MIC

2.小鼠急性結核病模型治療3周體質量變化：小鼠在感染及治療整個期間一般狀況良好，無死亡。小鼠感染前的平均體質量為(20.39±0.47) g，感染及治療過程中小鼠耐受性良好，無死亡。感染30 d即治療結束時，無藥空白對照組的平均體質量為(27.76±1.80) g； INH組及RFP組的平均體質量分別為(27.57±0.66) g、(27.83±1.10) g；圣露丸組的平均體質量為(27.85±1.08) g。

3.小鼠急性結核病模型治療3周全肺活菌計數：感染的第3天，小鼠全肺活菌數為1.58 lg CFU，證明感染成功。感染第10天即治療當日小鼠全肺活菌數為(2.90±0.39) lg CFU。治療結束時，解剖可見無藥空白對照組肺組織有較多的結核結節，病變較重； INH組及RFP組肺組織肉眼未見明顯結核結節；圣露丸組肺組織可見結核結節。無藥空白對照組小鼠全肺的活菌數為(7.12±0.28) lg CFU；INH組及 RFP組小鼠全肺的活菌數分別為(2.67±0.93) lg CFU和(6.31±0.07) lg CFU，較無藥空白對照組相比分別下降了4.45 lg CFU和0.81 lg CFU。圣露丸組小鼠全肺的活菌數為(6.81±0.71) lg CFU，較無藥空白對照組降低0.39 lg CFU。

4.小鼠急性結核病模型治療6周小鼠體質量的變化：小鼠在感染及治療整個期間一般狀況良好，無死亡。小鼠感染前的平均體質量為(19.48±0.37) g，感染60 d即治療結束時，無藥空白對照組的平均體質量是(31.93±0.59) g，INH組為(31.37±0.96) g；圣露丸組為(30.44±1.40) g。

5．小鼠急性結核病模型治療6周小鼠全肺活菌計數：感染的第3天，小鼠全肺活菌數為(1.66±0.27) lg CFU，證明感染成功。感染第10天即治療當日，小鼠全肺活菌數為(2.96±0.32) lg CFU。治療結束解剖時無藥空白對照組小鼠肺組織可見結核結節； INH組小鼠肺組織表面未見結節；圣露丸組小鼠肺組織可見結核結節。無藥空白對照組小鼠全肺的活菌數為(5.43±0.18) lg CFU；INH組小鼠全肺的活菌計數未見菌落生長；圣露丸組小鼠全肺的活菌數為 (4.33±0.51) lg CFU，較無藥對照組降低1.10 lg CFU。

討 論

結核病在中醫稱之為癆病，傳統醫學認為該病的產生有內外兩方面因素，外因為感染癆蟲，內因為正氣虛弱、氣血不足、陰精耗損所致。癆蟲是發病的因素，正氣虛弱是發病的基礎，體虛感染癆蟲是形成本病的關鍵[3]。傳統醫學針對結核病產生的內外因進行治療具有獨特的優勢，“一則補其虛，復其真元；一則殺其蟲，以絕其根本”[4]。

體外測定圣露丸對結核分枝桿菌H37Rv標準株的MIC實驗結果顯示,圣露丸至少需要達到2.5 mg/ml 的濃度才能起到對結核分枝桿菌的抑制作用。因為圣露丸為復方制劑，組分較多，起到直接抑菌作用的成分未知，所以在體外抑菌實驗中需要的劑量較大。也說明中藥的殺菌能力較化學藥品差，效果較為緩慢。

小鼠急性結核病模型是模擬人體急性感染狀態，即人體免疫反應未完全建立，結核分枝桿菌在肺組織中處于持續增殖狀態，評價的是藥物對結核分枝桿菌復制的抑制或直接殺滅作用。在小鼠急性感染結核病模型中，給藥15次后，圣露丸組較無藥空白對照組肺活菌數降低0.39 lg CFU，已經表現出在活菌計數上的直接降低，說明圣露丸具有抗結核感染的作用。在此基礎上，筆者繼續應用建立的小鼠急性結核病模型，給予更長時間的中藥治療。單獨應用中藥圣露丸治療30次后，較無藥空白對照組肺活菌數降低1.1 lg CFU。肺活菌計數是動物模型中評價藥物活性最為客觀的指標，此結果表明：在動物模型中單獨采用中藥圣露丸治療30次后表現出抗結核感染的活性。

中藥復方是在中醫理論指導下的組合，具有較為廣泛的作用位點，可以全面地調整機體狀態。中藥通過對多個系統及致病環節的聯合作用，達到治療疾病的目的。有研究結果表明，中藥抗癆主要通過增強機體免疫功能及在一定程度上抑制結核分枝桿菌的生長而達到治療的目的[5]。中藥配合西藥化療，不僅能促進痰菌陰轉、空洞閉合、病灶吸收及縮短療程，而且有緩解抗結核藥物不良反應的作用，改善肺結核患者的臨床癥狀，進而提高療效；同時可延緩耐藥性的產生[6-11]。圣露丸以益氣補血為基礎，健脾益氣的松花粉，補血的當歸為本方主藥；其旨在氣血通暢，百病自去。從圣露丸的作用成分推測，其抗結核感染作用的發揮一方面具有一定的直接抗結核分枝桿菌的作用，另一方面具有調節免疫功能的作用。至于其如何發揮抗結核感染的機制還需進行進一步研究。

中藥抗結核感染作用的體內藥效學評價模型非常關鍵，目前多用化學藥物的評價方法；本研究主要以肺組織活菌數為評價指標，表現出圣露丸具有一定的抗結核感染活性。當然也有必要同時增加病理和免疫指標以說明可能的作用機制，確定體內抗結核分枝桿菌藥效學實驗的觀察指標及制定中藥抗結核分枝桿菌藥效學實驗的標準方法十分必要[12]。

本研究結果顯示，中藥圣露丸具有一定的抗結核感染活性，值得進一步研究，可試用于臨床輔助治療抗結核化療中產生嚴重肝、腎損傷的患者，以及無藥可治的復治結核病和耐多藥結核病患者。

[1] 陸宇,鄭梅琴,王彬，等.氯法齊明抗結核分枝桿菌的體內外活性研究.中華結核和呼吸雜志，2008，31(10):752-755.

[2] Lu Y,Zheng M,Wang B,et al.Clofazimine analogs with efficacy against experimental tuberculosis and reduced potential for accumulation.Antimicrob Agents Chemother,2011,55(11):5185-5193.

[3] 趙霞，趙燁，朱國強．中藥在治療肺結核中的作用及地位．實用中醫內科雜志，2005，19(6)：506-507．

[4] 劉秋瓊，高玉橋，林秋曉，等．中藥治療肺結核的研究進展．中藥材，2007，30(11)：1478-1481．

[5] 凌彥博,梁艷,王小美,等.中藥復方牛貝消核提取物治療結核病相關靶標的研究.中國防癆雜志，2016，38(1)：17-22.

[6] 姚嵐，范琳.肺泰膠囊輔助治療肺結核的研究進展.中國防癆雜志,2016,38(1): 14-22.

[7] 劉曉，吳雪瓊.中藥治療耐多藥肺結核的研究進展.中國防癆雜志,2016,38(1): 53-56.

[8] 方勇,肖和平,周勤琦,等.芪甲利肺膠囊輔助治療初治肺結核的回顧性分析研究.中國防癆雜志,2014,36(3): 184-188.

[9] 席秀娥,李明瑛,王霞,等.芪甲利肺膠囊輔助治療復治肺結核的療效及安全性觀察.中國防癆雜志,2014,36(11): 948-952.

[10] 聶琦，陶立軒，袁冶，等.百令膠囊輔助治療首次復治菌陽肺結核患者的臨床研究.中國防癆雜志,2016,38(1): 61-63.

[11] 周穎，朱建民，周志英，等.中醫輔助治療對耐多藥肺結核患者細胞免疫狀態改善的影響.中國防癆雜志,2016,38(1): 32-37.

[12] Liang Y,Wang X,Song J,et al.Therapeutic effects of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe in mouse tuberculosis models.J Ethnopharmacol,2017,195:318-323.

Preliminarystudyonanti-tuberculosisactivityofShengluwan

WANGBin,FULei,XUJian,GUOShao-chen,ZHUHui,LUYu.

BeijingKeyLaboratoryofDrugResistanceTuberculosisResearch,DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the anti-tuberculosis activity of traditional Chinese medicine named Shengluwan in vitro and in mouse tuberculosis model.MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) of Shengluwan againstMycobacteriumtuberculosisstandard strain H37Rv was determined by 7H9 liquid medium and 7H10 solid medium.A mouse tuberculosis acute model was set up through aerosol infection to SPF BALB/C mice usingMycobacteriumtuberculosisstandard strain H37Rv.On the 10th day of infection,drug treatments were begun with 3 g/kg of Shengluwan or 25 mg/kg of isoniazid,respectively.Ten mice in each group were orally administered by gavage for 3 weeks or 6 weeks treatments.At the end of treatment,the mice were sacrificed,weighed,sterilized under sterile operation and lungs CFU counted.The CFU between the groups were compared.ResultsThe MIC of Shengluwan against H37Rv was 2.5 mg/ml in 7H9 liquid medium,and less than 5 mg/ml in 7H10 solid medium.All mice were tolerant during the period of infection and treatment.There were no death mouse.After administration of 3 weeks,the CFU of the lungs in Shengluwan group were (6.81±0.71) lg CFU,which was 0.39 lg CFU lower than that of the control group.After 6 weeks treatment,the CFU of the whole lungs was (4.33±0.51) lg CFU in the Shengluwan group,which was 1.10 lg CFU lower than the control group.ConclusionIn the mice tuberculosis model,Shengluwan shows the anti-tuberculosis activity in mice.It is worth further study in the future.

Mycobacteriumtuberculosis; Drugs,chinese herbal; Treatment outcome; Comparative study; Shenglu wan

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.018

北京市醫院管理局“登峰”計劃專項經費資助(DFL20151501)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 耐藥結核病研究北京市重點實驗室 北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

陸宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2017-08-25)

薛愛華)