基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥檢測中的效果分析

林明冠 吳元東 朱中元 林翀 陳灼霖 陳少文 蘇應仙 陳偉彬 鐘業騰

·論著·

基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥檢測中的效果分析

林明冠 吳元東 朱中元 林翀 陳灼霖 陳少文 蘇應仙 陳偉彬 鐘業騰

目的比較基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)在檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性中的應用效果。方法選取2013年9月至2016年12月海南醫學院第二附屬醫院598例涂陽肺結核住院患者的痰標本，具有傳統藥敏結果和基因芯片結果的484例患者納入分析。采用基因芯片法檢測rpoB、katG及inhA基因耐藥突變位點及頻率，以比例法藥敏試驗結果為金標準，比較兩種方法的符合率。結果基因芯片和比例法藥敏試驗檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥性符合率為93.8%(454/484)，對異煙肼的耐藥性符合率為89.0%(431/484)，對耐多藥的符合率為95.5%(462/484)。118株檢測到rpoB基因發生突變，優勢突變位點為531，占56.8%(67/118)；其次突變位點是526，占19.5%(23/118)；516突變位點占12.7%(15/118)。97株檢測到katG和inhA基因突變，最常見的突變位點是katG315，占82.5%(80/97)，inhA均為-15突變類型，占14.4%(14/97)。結論基因芯片法與比例法具有很好的一致性，可成為篩查結核分枝桿菌對利福平和異煙肼是否耐藥的快速有效的方法。

分枝桿菌，結核； 利福平； 異煙肼； 微生物敏感性試驗； 寡核苷酸序列分析； 評價研究

結核病仍是全世界公共衛生面臨的重大威脅[1]。2016年WHO全球結核病報告顯示，2015年全球約有1040萬例新發結核病患者，其中新發耐多藥(同時對利福平和異煙肼耐藥)結核病約48萬例，有約45%的患者來自印度、中國和俄羅斯[2]。由于MTB生長速度慢，傳統的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)周期較長，需4～8周才出結果，這不僅影響患者的早期診斷和治療，而且還加速了耐多藥結核病的傳播[3]。而基因芯片技術是一種通過檢測標本中MTB的rpoB、katG和inhA基因的突變情況，從而判定其對利福平和異煙肼的耐藥性，具有快速、簡便、高通量等特點，一次能夠同時檢測十幾至幾十個基因位點，適用于多位點分析[4]。目前，國內外很多機構已經開展了基因芯片技術檢測MTB耐藥性的研究，但這些研究基本上是對MTB分離菌株進行檢測；而在結核病防治工作中則是對患者的痰標本進行檢測，但國內外較少有研究采用基因芯片技術對痰標本進行檢測的效果進行評價。筆者以傳統羅氏培養和藥敏試驗為金標準，應用基因芯片技術對海南地區涂陽肺結核患者痰標本中MTB進行耐藥基因檢測，對兩種檢測技術的一致性進行評價。

資料和方法

一、資料

1.研究對象：選擇2013年9月至2016年12月海南醫學院第二附屬醫院痰涂片陽性肺結核住院患者598例納入觀察。每例患者留取清晨第一口痰標本，每人2～3份痰標本，每份標本2～5 ml，經檢測后，留取涂片陽性級別較高的2份，各取1 ml混勻，同時進行傳統培養藥敏試驗和基因芯片檢測。質控菌株為H37Rv(ATCC27294)標準株，由國家結核參比實驗室提供。

2.儀器與試劑：利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星和卡那霉素純藥粉由美國Sigma公司提供；改良羅氏培養基及含藥物的改良羅氏培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司；基因芯片檢測系統及配套試劑均為北京博奧生物有限公司生產，包括ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slide WasherTM8芯片洗干儀、LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等；Life Express基因擴增儀由杭州博日科技有限公司生產。

二、方法

1.菌種初步鑒定：按《結核病診斷細菌學檢驗規程》規定要求處理MTB臨床分離株[5]，接種到酸性改良羅氏培養基上進行MTB分離培養。對培養陽性菌株采用濃度為500 mg/L的對硝基苯甲酸(PNB)進行結核分枝桿菌復合群初步鑒定，在PNB培養基上生長的為非結核分枝桿菌，不生長的即為MTB。

2.傳統比例法藥敏試驗：用接種環取一環培養基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1 mg/ml菌懸液，梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種到含利福平(40 mg/L)、異煙肼(0.2 mg/L)、鏈霉素(4 mg/L)、乙胺丁醇(2 mg/L)、左氧氟沙星(2 mg/L)和卡那霉素(30 mg/L)的藥敏培養基上，放入細菌培養箱中，37 ℃培養6周，觀察結果。含藥培養基生長的菌落≥不含藥培養基的1%，判定為耐藥；<不含藥培養基的1%，判定為敏感。

3.基因芯片法：將消化液(10 ml 2.94%檸檬酸三鈉、10 ml 4%氫氧化鈉、0.1 g N-乙酰-L-半胱氨酸)預處理好的痰標本放入晶芯ExtractorTM核酸快速提取儀中提取核酸，將提取的核酸放入基因擴增儀中進行擴增，將基因擴增產物經變性后加入到MTB耐藥檢測試劑盒的芯片點陣中，然后放入晶芯BioMixerTMⅡ雜交儀進行芯片反應，再將完成雜交的芯片放入晶芯Slide WasherTM8芯片洗干儀中進行洗干，將洗干的芯片載入晶芯LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀中，自動進行結果判讀。

4.統計學分析：實驗數據采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，兩種方法檢測結果的一致性用Kappa檢驗判別(Kappa≥0.75，兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4，兩者一致性一般；Kappa<0.4，兩者一致性較差)。采用χ2檢驗比較基因芯片法和傳統比例法檢測結果的差異，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、檢測一般情況

在598例培養的標本中，有49例培養陰性(8.2%，49/598)，27例培養污染(4.5%，27/598)，在進行傳統藥敏試驗和菌種鑒定的522例分離株中，有25例鑒定結果為NTM(4.8%，25/522)，最后獲得可用于分析藥敏試驗結果者484例。在進行芯片檢測的標本中，未檢測到MTB者33例(5.5%，33/598)、NTM 25例(4.2%，25/598)，無法判讀結果3例(0.5%，3/598)，總計獲得可用于分析基因芯片結果者537例。綜合傳統藥敏試驗結果和基因芯片結果，總計有484例患者的檢測結果進行了對利福平和異煙肼的藥物敏感性比較。

二、基因芯片與比例法藥敏試驗對利福平的耐藥性檢測結果

基因芯片能夠同時完成MTB對利福平和異煙肼的耐藥性檢測。對利福平的耐藥性檢測，基因芯片結果與傳統藥敏試驗結果一致率為93.8% (454/484)，敏感度為92.3% (96/104)，特異度為94.2% (358/380)，陽性預測值和陰性預測值分別為81.4%(96/118)和98.4%(358/364)。經χ2檢驗，兩種方法對檢測利福平耐藥率的差異具有統計學意義(χ2=331.5，P<0.001)，Kappa值為0.825，兩種方法一致性較好(表1)。

三、基因芯片與比例法藥敏試驗對異煙肼的耐藥性檢測結果

對于異煙肼的耐藥性檢測，兩種方法檢測結果差異具有統計學意義(χ2=197.5,P<0.001)。基因芯片檢測與傳統藥敏試驗結果的一致率為89.0% (431/484)，基因芯片技術檢測的敏感度為77.5% (62/80)，特異度為91.3% (369/404)，陽性預測值和陰性預測值分別為63.9%(62/97)和95.3%(369/387)。經χ2檢驗，兩種方法檢測對異煙肼的耐藥率差異具有統計學意義(χ2=197.5，P<0.001)，Kappa值為0.634，兩種方法一致性一般(表2)。

四、基因芯片與比例法藥敏試驗對耐多藥結核病的檢測結果

綜合基因芯片和比例法藥敏試驗對患者利福平和異煙肼檢測的結果，統計了對耐多藥結核病的診斷效果，如表3所示。其中462例(95.5%,462/484)患者基因芯片檢測與比例法藥敏試驗的診斷結果一致。基因芯片技術檢測的敏感度為69.6% (32/46)，特異度為98.2% (430/438)，基因芯片檢測耐多藥結核病的陽性預測值和陰性預測值分別為80.0%(32/40)和96.8%(430/444)。經χ2檢驗，兩種方法檢測對耐多藥結核病的耐藥率差異具有統計學意義(χ2=251.9，P<0.001)，Kappa值為0.719，兩種方法一致性較好。

表1 基因芯片技術與比例法藥敏試驗檢測菌株對利福平的耐藥結果比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表2 基因芯片技術與比例法藥敏試驗檢測菌株對異煙肼的耐藥結果比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表3 基因芯片技術與比例法藥敏試驗檢測菌株對耐多藥結核病的結果比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表4 基因芯片檢測118株突變型菌株rpoB、katG和inhA基因耐藥相關突變位點的分布

五、基因芯片對耐藥基因檢測的結果

基因芯片檢測耐利福平基因時，野生型(即敏感)366株，突變型(即耐藥)118株，包括96株表型耐藥菌株和22株表型敏感菌株，其中112株存在單一位點突變，6株存在雙位點突變。rpoB突變頻率最高的位點是531，突變率是56.8%，其次是526位點，突變頻率是19.5%。基因芯片檢測耐異煙肼基因時，野生型387株，突變型97株，包括62株表型耐藥菌株和35株表型敏感菌株，其中80株是katG315位點的單一突變，突變率是82.5%，14株是inhA啟動子區的突變，突變率是14.4%，katG的315位點和inhA的啟動子區域存在雙突變的菌株有3株，占全部突變菌株的3.1%(表4)。

討 論

近年來，MTB耐藥性呈逐年上升趨勢，耐藥性問題已經成為結核病控制的難題之一，因此結核病耐藥性檢測尤為重要[6]。而利福平和異煙肼作為最主要的一線抗結核藥物，其耐藥性檢測對于臨床選擇抗結核病藥物有重要意義[7]。WHO推薦使用的比例法藥敏試驗穩定性好，但需4周上的時間，無法為臨床提供及時的用藥參考。而基因芯片技術是20世紀90年代發展起來的分子生物學技術，通過檢測耐藥基因的位點突變來預測表型耐藥，從而可快速準確地檢測MTB對藥物的耐藥性，具有快速、準確、高通量等特點，成為近年來研究的熱點。本研究利用基因芯片技術直接對涂陽肺結核患者的痰標本進行檢測，以傳統藥敏試驗為金標準，通過檢測MTB的katG、inhA和rpoB基因突變對異煙肼和利福平的耐藥性進行檢測。

本研究598例抗酸染色涂片陽性的患者中，基因芯片法和培養法各檢出非結核分枝桿菌25例，符合率為100%；與李曉非等[8]報道的100%一致，與何莉等[9]報道的95.8%接近，說明基因芯片技術對結核病的確診有較大幫助。本研究進一步比較了基因芯片和比例法藥敏試驗檢測MTB對利福平和異煙肼的耐藥性差異，結果顯示，兩種方法檢測MTB對利福平和異煙肼是否耐藥的結果一致率分別為93.8%和89.0%，敏感度為92.3%和77.5%，特異度為94.2%和91.3%。這與河南[10]、湖北[11]和河北[12]等地區報道的結果相似。根據Kappa值，基因芯片與比例法藥敏試驗對利福平耐藥性檢測結果的一致性較好(Kappa=0.825)，對異煙肼耐藥性檢測結果的一致性一般(Kappa=0.634)，與孫炳奇等[7]的研究結果一致；這可能是由于MTB對異煙肼耐藥基因的突變有多個基因位點，而基因芯片技術只檢測2個固定位點，可能導致其敏感度降低。而診斷耐多藥結核病的敏感度(69.6%)低于單耐利福平和單耐異煙肼的敏感度，特異度(98.2%)與單耐利福平和單耐異煙肼相似，符合率為95.5%。這與耿紅等[13]采用Meta分析表明的基因芯片對耐多藥結核病診斷的敏感度和特異度分別為75%和97%一致。這表明在實際應用中基因芯片技術對痰標本的MTB耐藥檢測結果均具有較高的可靠性，其中是否對利福平耐藥的檢測可靠性高于是否對異煙肼耐藥的檢測可靠性。

本研究發現，與傳統藥敏試驗相比，基因芯片技術檢測對利福平耐藥的陽性預測值和陰性預測值分別為81.4%和98.4%，檢測對異煙肼耐藥的陽性預測值和陰性預測值分別為63.9%和95.3%。張瑞梅等[14]研究發現，以痰標本為檢測標本，與傳統藥敏試驗相比，基因芯片技術檢測對利福平耐藥的陽性預測值和陰性預測值分別為71.4%和92.7%，檢測對異煙肼耐藥的陽性預測值和陰性預測值分別為54.5%和90.0%，與本研究結果相似。這表明基因芯片技術在臨床實際中有較好的應用價值。

有學者研究表明，約有95%或更高比例的MTB對利福平耐藥與rpoB基因的507～533位密碼子的81 bp耐藥決定區突變有關，90%的點突變發生在該區域11個氨基酸密碼子之一的部位，其中最常見的突變位點是531位、526位和516位[15]。本研究中6個突變位點均位于利福平耐藥決定區域內，而531、526和516位點突變者占總耐藥菌株的89.0%；其中531突變者占56.8%、526突變者占19.5%、516突變者占12.7%，這與之前北京[16]、河南[17]和武漢等[18]地區的研究結果相似，表明各地區之間MTB對利福平耐藥的rpoB基因突變位點和頻率區別不大。研究表明katG和inhA基因突變導致MTB對異煙肼耐藥，其中katG基因315密碼子的突變大約在50%～90%的異煙肼耐藥株中出現[15]。本研究顯示，82.5%的菌株在katG基因315位點有單一突變，是本地區最常見的對異煙肼耐藥的突變類型，略高于江西(65.8%)、上海(72.7%)和貴州(78.06%)，與福建(82.7%)相似，低于河北(89.9%)，這與之前研究表明katG基因315密碼子突變發生率有較大的地區差異一致[19]，這可能與不同地區的菌株來源及樣本量差異有關。此外，研究表明3%～30%的耐異煙肼菌株中存在inhA啟動子區突變，最常見的突變類型是-15(C) C→T[15]。本研究結果顯示，14.4%的菌株在inhA基因15(C)位點有突變，這與其他研究結果相似[16-18]。

由于痰標本中MTB的培養及其耐藥性檢測周期長，而應用基因芯片技術，只需1～2 d，將大大縮短檢測時間，提高自動化程度，為患者的及時治療提供有利條件。本研究表明，基因芯片法可以快速檢測涂陽肺結核患者的痰標本對利福平和異煙肼的耐藥性，從而快速診斷耐多藥結核病，在耐藥結核病的臨床診斷和防治工作的實際應用中具有廣闊的應用前景。此外，海南地區MTB對利福平和異煙肼耐藥以ropB基因531、526突變位點及katG315突變位點為主。

[1] L?nnroth K,Castro KG,Chakaya JM,et al.Tuberculosiscontrol and elimination 2010-50：cure,care,and social deve-lopment.Lancet,2010,375(9728): 1814-1829.

[2] World Health Organization.Global tuberculosis report 2016.Geneva：World Health Organization,2016.

[3] 石國民,喻容,彭雪峰,等.基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥檢測及菌種鑒定中的應用.中國防癆雜志,2015,37 (1): 66-73.

[4] Guo Y,Zhou Y,Wang C,et al.Rapidaccurate determination of multidrug resistance inM.tuberculosisisolates andsputum using a biochip system．Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(7): 914-920.

[5] 中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程.中國防癆雜志,1996,18(3): 127-134.

[6] 吳玉姣,朱珊梅,徐軍英,等.基因芯片與羅氏絕對濃度法對結核分枝桿菌耐藥檢測的效果比較.檢驗醫學與臨床,2016,13(10): 1325-1327.

[7] 孫炳奇,張娟,孫嬌,等.基因芯片技術檢測結核桿菌耐藥的臨床研究.中國實驗診斷學,2014,18(3): 127-135.

[8] 李曉非,梁桂亮,普東,等.基因芯片技術在分枝桿菌菌種鑒定和結核耐藥性檢測中的應用及評價.中國實驗診斷學,2015,19(2): 204-207.

[9] 何莉,任薇,梁雪妮,等.DNA芯片檢測分枝桿菌的臨床應用價值.中華臨床醫師雜志(電子版),2013,7(23): 10611-10613.

[10] 李衛彬,李新旭,張彤群,等.基因芯片檢測技術檢測結核分枝桿菌異煙肼和利福平耐藥的實際應用效果評價.中華臨床醫師雜志(電子版),2012,6(16): 4666-4670.

[11] 胡曉紅,向啟云,莊倩,等.基因芯片法檢測結核分枝桿菌耐藥性的可行性分析.國際檢驗醫學雜志,2015,12(23): 3421-3422.

[12] 張海英,高會霞,許怡,等.基因芯片方法快速檢測醞閱砸原栽月及利福平和異煙肼耐藥基因的研究.河北醫科大學學報,2012,12(33): 1421-1424.

[13] 耿紅,李永文,李新旭,等.中國開展基因芯片檢測結核分枝桿菌對異煙肼和利福平耐藥性的Meta分析.中華傳染病雜志,2014,32(6): 357-363.

[14] 張瑞梅，劉成永，申濤，等.變色液體培養技術和基因芯片技術檢測結核桿菌耐藥的方法比較及其臨床應用.臨床肺科雜志,2009,14(3): 408-411.

[15] 張俊仙,吳雪瓊,陽幼榮,等.應用基因芯片方法檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼的耐藥性.中國防癆雜志,2011,33(10): 680-685.

[16] Mokrousov I,Jiao WW,Sun GZ,et al.Evaluation of therpoBmacroarray assay to detect rifampin resistanceMycobac-teriumtuberculosisin Beijing China．Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2006,25(11): 703-710.

[17] Zhang SL,Shen JG,Xu PH,et al.A noveI genotypic test forrapid detection of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates by a multiplex probe array.J Appl Microbiol,2007,103(4): 1262-1271.

[18] Deng JY,Zhang XE,Lu HB,et al.Multiplex dctcctlon ofmutations in clinical isolates of rifampin-resistantMycobacteriumtuberculosisby short oligonucleotide ligation assay on DNA chips.J Clin Microbiol,2004,42(10): 4850-4852.

[19] 戎奇吉,呂火祥,孫愛華.基因芯片快速檢測結核分枝桿菌katG基因突變及其與異煙肼耐藥相關性.中國人獸共患病學報,2011,27(3): 233-237.

EvaluationofGenechipforthedetectionofdrugresistanceofMycobacteriumtuberculosis

LINMing-guan*,WUYuan-dong,ZHUZhong-yuan,LINChong,CHENZhuo-lin,CHENShao-wen,SUYing-xian,CHENWei-bin,ZHONGYe-teng.

*DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570311,China

ZHONGYe-teng,Email:zhongyeteng@163.com

ObjectiveTo compare Genechip and the proportion method drug susceptibility test in detectingMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin and isoniazid.MethodsA total of 598 sputum specimens of sputum smear-positive pulmonary tuberculosis inpatient cases from the Affiliated Hospital of Hainan Medical College between September 2013 and December 2016.Finally,484 patients with the results of both traditional drug susceptibility test and Genechip were included.Genechip was used to detect the mutations and frequencies ofrpoB,katGandinhA.The proportion method drug susceptibility test was used as the gold standard to evaluate the overall concordance.ResultsCompared with the proportion method drug susceptibility test,the coincidence rate ofMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin and isoniazid detected by Genechip was 93.8% (454/484) and 89.0% (431/484),respectively,and that to multi-drug resistance was 95.5% (462/484).TherpoBmutations were detected in 118 strains,of which 56.8% (67/118) carried mutations at codon 531,19.5% (23/118) at codon 526,12.7% (15/118) at codon 516.Of all the 97 strains withkatGandinhAmutations,the predominant mutation site ofkatGwas codon 315 with the mutation rate of 82.5% (80/97),and 14.4% (14/97) carried mutations atinhA-15 (C→T).ConclusionThe results of Genechip method were highly consistent with that of proportion method drug susceptibility test,and Genechip was a fast and effective method for screening for rifampin and isoniazid againstMycobacteriumtuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; Rifampin; Isoniazid; Microbial sensitivity tests; Oligonucletide array sequence analysis; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.014

570311 海口，海南醫學院第二附屬醫院檢驗科(林明冠、朱中元、林翀、陳灼霖、陳少文、蘇應仙、陳偉彬、鐘業騰)；海南省儋州市疾病預防控制中心(吳元東)

鐘業騰，Email: zhongyeteng@163.com

注：林明冠和吳元東對本文有同等貢獻，為并列第一作者

2017-07-14)

范永德)