三種結核抗體試劑盒在結核病診斷中的應用評價

劉楠楠 梁建琴 王金河 陳志 武麗紅 劉景陽

·論著·

三種結核抗體試劑盒在結核病診斷中的應用評價

劉楠楠 梁建琴 王金河 陳志 武麗紅 劉景陽

結核； 病理學,分子； 抗原抗體反應； 實驗室技術和方法； 診斷； 評價研究

結核病是全球感染性疾病中發病率和死亡率最高的疾病之一，是威脅全球和我國人群健康的公共衛生問題[1]。結核病疫情嚴峻，但由于其臨床癥狀和體征不典型，診斷和鑒別診斷較困難，導致漏診率和誤診率較高，從而延誤最佳治療時機。因此，迫切需要快速、簡便、準確的結核病實驗室診斷方法，指導臨床開展早期有效的診治工作。

目前，結核病的實驗室診斷手段主要包括細菌學、病理學、分子生物學、免疫學等檢測方法，其中因血清免疫學檢測具有操作簡便、快速實用、對活動性結核病具有輔助診斷價值而備受結核病領域學者的廣泛關注[2]。為進一步了解目前臨床上常用的3種結核抗體試劑盒在診斷結核病中的應用價值，本研究將3種結核抗體(TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT)試劑盒檢測外周血結核抗體的結果與聚合酶鏈反應反向斑點雜交法(polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB)行分枝桿菌菌種鑒定(以下簡稱“分子病理”)的結果進行比較，為臨床結核抗體檢測效能的評價提供參考。

資料和方法

1.研究對象：收集2015年1—12月解放軍第三〇九醫院病理科有組織標本分子病理結果的601例患者資料，剔除重復、門診、院外會診患者89例，及分子病理為非結核分枝桿菌者7例[戈登分枝桿菌(MGO)6例，龜分枝桿菌(MCH)1例]、病理診斷不明確者149例和未行結核抗體檢測者151例，最終納入205例患者資料。205例患者中男127例、女78例，年齡12～87歲，中位年齡47歲。205例患者的病理標本中，胸腹膜組織88例、骨關節脊柱組織54例、支氣管肺組織47例、腎輸尿管膀胱組織11例、胸腹壁軟組織2例、胃腸組織1例、附睪組織1例、輸卵管組織1例。

2.實驗試劑：3種結核抗體檢測試劑盒分別為TB-IgG[北京中檢安泰診斷科技有限公司，膠體金法，相對分子質量38 000(38 kD)+相對分子質量16 000(16 kD)]、SD Rapid TB(韓國SD 標準診斷公司，膠體金法，38 kD+其他混合抗原)、TB-DOT(上海奧普生物醫藥有限公司，膠體金法，38 kD)；分子病理試劑盒[亞能生物技術(深圳)有限公司，分枝桿菌菌種鑒定]。

3.實驗方法：(1)血清結核抗體檢測：采集住院患者的晨起靜脈血4 ml于帶凝膠的紅帽血清管中，標本按常規法分離、貯存。實驗步驟嚴格按3種試劑盒說明書的要求進行，每份血清標本均用3種試劑平行測定。(2) 組織分子病理檢查：組織標本DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色等嚴格按照亞能生物技術(深圳)有限公司分枝桿菌菌種鑒定檢測試劑盒要求執行[3]。

4.結果判定：(1)分子病理診斷：試驗膜條上共有24個探針位點，臨床樣本與相對應探針雜交位點顯色，表明被檢樣本檢測到相對應的分枝桿菌DNA。該研究試驗膜條上結核分枝桿菌復合群(MTC)顯色為分子病理陽性，不顯色為分子病理陰性[3]。(2)血清TB-IgG抗體檢測試劑盒結果判定：①陰性即只在質控線C位置出現一條紅色條帶；②陽性即質控線C和檢測線T位置出現2條紅色條帶；③無效即質控線C位置沒有出現紅色條帶。(3)SD Rapid TB抗體檢測試劑盒結果判定：①陰性即顯示窗內僅出現一條紫色線；②陽性即顯示窗內出現2條彩色線(T線和C線)，或任一條線出現，均說明結果陽性；③無效即顯示窗內未出現紫色線。(4)TB-DOT抗體檢測試劑盒結果判定：①陰性即質控點顯示紅色，反應孔中間無紅色斑點出現或僅為痕跡；②陽性即質控點顯示紅色，反應孔中間有紅色斑點出現。上述結果中陽性提示感染結核分枝桿菌，陰性表示未感染結核分枝桿菌。

5.統計學分析：應用SPSS 20.0統計學軟件，采用McNemar檢驗對3種結核抗體試劑盒檢測結果與分子病理診斷結果進行比較，有小于5的理論數，采用McNemar檢驗的Continuity Correction(連續矯正)檢驗，均以P<0.05認為差異有統計學意義。采用Kappa檢驗檢測結果的一致性，將Kappa系數的大小劃分了6個區段，分別代表一致性的強弱程度：(1)Kappa值<0.00則為一致性強度極差；(2)Kappa值0.00～0.20則為一致性微弱；(3)Kappa值0.21～0.40則為一致性弱；(4)Kappa值0.41～0.60則為中度一致性；(5)Kappa值0.61～0.80則為高度一致性；(6)Kappa值0.81～1.00則為極強一致性。

結 果

1.分子病理檢測情況：205例患者中，傳統病理診斷為結核病(結核病組)且分子病理檢測陽性者128例，均為結核分枝桿菌復合群，分別為脊柱骨關節結核37例，腹盆腔結核(結核性腹膜炎、腸結核、輸卵管結核)35例，結核性胸膜炎31例，支氣管結核肺結核19例，腎結核4例，胸腹壁結核1例，附睪結核1例；傳統病理診斷明確為非結核病(非結核病組，不包括7例非結核分枝桿菌感染患者)且分子病理檢出陰性者77例，分別為胸腹膜間皮瘤15例，肺癌12例，肺炎9例，肺良性腫瘤7例，骨關節感染11例，脊柱布氏桿菌病6例，胃腸道腫瘤8例，泌尿系腫瘤7例，肝腫瘤1例，乳腺脂肪瘤1例。

2.結核抗體試劑盒的檢測效能：以分子病理檢查結果為標準， TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT等3種試劑盒的敏感度分別為26.6%(34/128)、20.3%(26/128)、97.7%(125/128)；特異度分別為90.9%(70/77)、98.7%(76/77)、3.9%(3/77)；陽性預測值分別為82.9%(34/41)、96.3%(26/27)、62.8%(125/199)；陰性預測值分別為42.7%(70/164)、42.7%(76/178)、50.0%(3/6)；正確指數分別為0.18、0.19、0.02，見表1。

3.試劑盒檢測結果的差異性和一致性比較：從表1看，TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒的檢測結果與分子病理結果比較，診斷差異均有統計學意義(P值均<0.05)；Kappa值均在0.00～0.20范圍內，表明與分子病理結果均存在微弱的一致性。而TB-DOT試劑盒檢測結果與分子病理結果比較，診斷差異無統計學意義(P>0.05)；Kappa值=0.02，不能肯定與分子病理結果存在一致性。

討 論

我國現行的結核病診斷標準仍是依據臨床表現、影像學表現、細菌病原學和免疫學等檢查結果。但WHO在2010年12月正式推薦使用Gene Xpert MTB/RIF檢測技術作為一種全新的結核病分子生物學快速檢測方法，用于結核病及利福平耐藥的診斷。由于肺外結核的病原不易獲得，大多依靠影像學和治療效果進行診斷，所以對MTB-DNA檢測(分子病理)在診斷肺外結核中的應用越來越得到臨床醫生的認可，對疑似結核病和肺外結核的診斷具有輔助作用。結核抗體檢測對活動性結核病的診斷具有重要意義，尤其對涂陰、培陰、無痰、少痰及肺外結核是首選的檢測手段[4-5]。外周血結核抗體檢測具有快速、簡便、敏感等優勢[6]，其陽性檢出率(80.0%)明顯高于痰涂片法(28.1%)[7]和培養法(48.7%)[8]，較痰涂片、培養法(周期2～8周)更具應用價值，尤其在感染早期MTB菌量少或化療后細菌變異、死亡而難以培養時，其檢測優勢更明顯[9]。

結核抗體是機體受到結核分枝桿菌刺激后產生的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE等，其中IgG、IgM和IgA常用于臨床輔助診斷。在結核病發病過程中，最初是IgM升高，隨后IgG持續升高，并貫穿結核病始末，與高荷菌量相關聯[10]。喬帥[11]的研究表明，非活動性肺結核的結核抗體檢測陽性率為53.85%，而活動性肺結核的陽性率則高達94.59%。38 kD、30 kD、27 kD、16 kD是從結核分枝桿菌中提取的蛋白，能與血清IgG、IgA、IgM特異性結合。研究發現，單個抗原的檢測敏感度為57%～67%，當與38 kD聯合應用時，在結核分枝桿菌陽性者中其敏感度提高至91%，在結核分枝桿菌陰性者中提高至78%、特異度提高至97%[12]；Wu等[13]也有類似的報道。由此可見，結核病的快速、準確診斷有賴于多種抗原聯合檢測來提高敏感度和特異度，而38 kD在提高檢測敏感度和特異度方面效果顯著。

表1 3種結核抗體試劑盒的檢測效能比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%[a/(a+c)×100%]；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%[d/(b+d)×100%];陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%[a/(a+b)×100%];陰性預測值=真陰性例數/(假陰性例數+真陰性例數)×100%[d/(c+d)×100%];正確指數(約登指數)=(敏感度+特異度)-1；e：3種結核抗體試劑盒的檢測結果與分子病理檢測結果的統計學檢驗結果；f:Kappa值的檢驗值，因理論頻數小于5，為用McNemar檢驗連續矯正(continuity correction)的檢驗值

本研究中3種試劑盒均含有38 kD，其中，TB-DOT 試劑盒僅有38 kD單抗原，檢測敏感度高達97.7%，但特異度較低(3.9%)，陽性預測值為62.8%，陰性預測值為50.0%，與以往報道(敏感度為50%～75%，特異度為91.64%)不一致[6,14]。另外，該試劑盒與分子病理比較，正確指數僅為0.02，Kappa值為0.02，P>0.05，不能肯定兩種方法存在一致性。由此可見，TB-DOT試劑盒雖檢測敏感度高，降低了漏診率，但特異度低導致誤診率大大增加，不能滿足臨床需求。故本研究結果提示，不推薦其作為臨床治療有效的檢測手段。原因一方面由于用于血清學檢測的抗原較多，不同的抗原自身特性不同，加之患者的不同病程階段對每種抗原的反應也存在差異，必將影響相應抗體檢測的敏感度和特異度。所以，試劑盒僅含有38 kD抗原，只檢測38 kD抗原無法檢測出患者血清中的其他抗結核抗體。另一方面可能與試劑盒的批次、質量、結核分枝桿菌變異、質量控制等有密切關系，影響了其在臨床上的應用。TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒為38 kD與其他抗原的混合；與TB-DOT相比，在特異度方面明顯提升(90.9%，98.7%)，但敏感度(26.6%、20.3%)均較低。但多數研究結果提示，TB-IgG的敏感度(78.08%)高于本研究結果(26.6%)[2]，可能由于試劑盒的質量、批次、保存條件、操作員判讀、患者低免疫球蛋白水平和自身抗體等原因，出現一些假陰性。但本研究TB-IgG特異度為90.9%，更有助于結核病的確診。SD Rapid TB檢測的敏感度、特異度分別為20.3%、98.7%，這與相關文獻的報道結果(24.1%～39.2%)基本一致[15-16]。本研究中，TB-IgG試劑盒檢測結果與分子病理診斷結果比較，正確指數為0.18，Kappa值為0.14；而SD Rapid TB試劑盒的正確指數為0.19，Kappa值為0.15。由此可知，TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒檢測結果均與分子病理診斷結果存在微弱的一致性，但SD Rapid TB的Kappa值和正確指數稍高，在3種檢測方法中相對較好。

本研究將3種結核抗體試劑盒檢測結果與分子病理結果進行比較，在國內外尚未見報道。本研究傳統病理診斷明確的205例行分子病理檢測的組織標本中僅有47例來自于支氣管肺組織，其余158例均為肺外組織標本，推測TB-IgG和SD Rapid TB 2個試劑盒檢測的敏感度較低，可能與分子病理檢測的是MTB DNA而不是活菌有關，也就是說我院的手術標本中有部分可能是陳舊性或穩定性的肺外結核。下一步筆者將追蹤患者的其他指標，如現病史、既往史、血紅細胞沉降率、病理抗酸染色和培養、治療效果和不同治療階段抗體水平等，綜合客觀地判斷結核抗體對肺結核、肺外結核的臨床輔助診斷價值。

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Evaluationofthreetuberculosisantibodykitsintuberculosisdiagnosis

LIUNan-nan,LIANGJian-qin,WANGJin-he,CHENZhi,WULi-hong,LIUJing-yang.

DepartmentofTuberculosis,theTuberculosisReserchInsititute,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

LIANGJian-qin,Email:ljqbj309@163.com

Tuberculosis； Pathology,molecular; Antigen-antibody reactions; Laboratory techniques and procedures; Diagnosis; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.010

100091 北京，解放軍第三〇九醫院 全軍結核病研究所結核二科

梁建琴，Email：ljqbj309@163.com

2017-09-27)

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