提高新城疫LaSota株疫苗效價研究

杜海江

摘要 目前所生產的新城疫LaSota株疫苗的病毒效價仍有一定的提高空間，而病毒效價可極大地影響疫苗本身的質量。針對這一問題，本文利用正交試驗原理，對影響疫苗效價的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素進行試驗設計。結果表明，溫度為36 ℃、濕度為55%、照蛋間隔時間2 h為最佳生產方案，該方案能有效提高疫苗效價，從而提高疫苗的質量。

關鍵詞 新城疫LaSota株；疫苗效價；后孵化溫度；后孵化濕度；照蛋時間間隔

中圖分類號 S852.4+3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）20-0213-02

新城疫LaSota株是副黏病毒屬的一個代表病毒，直徑為100～250 nm，有囊膜，通常呈圓形，但常因囊膜破損而變得不規則，也常見橫斷面100 nm左右的不同長度的細絲，呈現出多形性病毒粒子[1]，在10～12日齡雞胚的絨毛尿囊膜或尿囊腔中生長，接種24～36 h病毒滴度可達到1010 EID50/mL。雞胚經24～72 h死亡，出現血性病變和腦炎[2]。LaSota亦即L系苗，在新城疫弱毒疫苗中毒力最強，易感雛雞，在接種后反應較重，一般不能用于2周齡以下的小雞免疫[3]。試驗發現，用哺乳動物細胞（如牛和豬的腎細胞）也可以培育此病毒，但病毒免疫原性差且滴度低于接種病毒。因此，雞胚接種是目前最常用的方法。雞胚苗中滴度>108 EID50/mL的可作活疫苗，滴度>107 EID50/mL的只可制作滅活苗，制成滅活苗明顯降低了產品利潤空間，再者疫苗滴度的高低也是疫苗質量好壞的一個重要指標。因此，如何提高疫苗滴度已成為亟待解決的問題[4]。本試驗采用生物統計的方法對影響疫苗效價的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素進行試驗設計，得出最佳的生產方案，有效提高了疫苗的效價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種毒為新城疫LaSota株，由中國獸醫藥品監察所提供，生產前要先進行種毒繼代，但不要超過3代。SPF雞蛋（無特定病原體雞蛋）由SPF雞舍生產。微量移液器（一道及八道）、微孔板（v型96°）、振蕩器、孵化器由熱電（上海）儀器有限公司生產。0.85%生理鹽水、5%碘酊、阿氏液按《獸用生物制品規程》（2000版）有關規定制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 1%雞血紅細胞配制。消毒取血部位，用一次性5 mL注射器抽取健康公雞的翅下靜脈血，抽3只，每只抽3 mL，然后加入等量阿氏液中混合均勻，用生理鹽水洗滌3次，轉速1 500 r/min，離心5 min，每次洗滌后吸棄上清液，包括紅細胞上的白細胞層。最后用生理鹽水配成1%雞血紅細胞（1 mL雞血細胞加99 mL生理鹽水）。

1.2.2 雞胚前孵化。SPF蛋入孵前先用40～45 ℃含0.1%新潔爾滅的溫水浸泡消毒，并用紗布擦拭雞蛋表面，除去表面污物，同時挑除沙殼蛋、畸形蛋及破蛋。消毒好的蛋放入孵化器孵化（溫度38℃，濕度65%），翻蛋次數10次/h。孵化5 d后一照，剔除無精蛋、破蛋及死胚蛋[5]。孵化10 d后二照，剔除死胚蛋并畫蛋，在雞胚胎面畫出氣室邊緣線，在臍帶或雞頭部周圍避開大血管畫出一小圓圈，即接種部位。

1.2.3 雞胚接種及后孵。①接種。用0.1%新潔爾滅對10日齡雞胚進行表面消毒，再用5%碘酊消毒接種部位，5 min后于接種部位打孔，同時將生產用種毒稀釋5萬～10萬倍，在萬級下局部百級的環境中進行接種操作：用帶有5號針頭的卡介苗注射器沿雞胚長軸方向與蛋殼面成45°進針，每胚接種0.1 mL，接種后用蠟封住接種口。②后孵化。將接種完的1 881枚雞胚隨機分成9組，每組209枚，分別于以下不同試驗條件下后孵化，具體如表1所示。

1.2.4 照蛋。接種60 h后按照不同時間間隔照蛋，將每一時期死亡胚體放入專用蛋盤，置于2～8 ℃中冷藏，96 h后的活胚待冷卻后也放入2～8 ℃冷藏20 h。每組雞胚分開放置，60 h以前的死胚棄去。

1.2.5 收苗。于緩沖間內用0.1%新潔爾滅擦拭雞蛋表面，然后于萬級下局部百級環境中用5%碘酊消毒氣室周圍，小心敲去氣室周圍蛋殼，不要弄破絨毛尿囊膜以免污染，用潔凈注射器收取尿囊液，不要刺破卵黃，不收污染胚。收集每種試驗方案的胚液，加入雙抗（青霉素和慶大霉素）混勻，共9份。

1.2.6 測定病毒血凝價。每份尿囊液各取20 mL用于血凝試驗，將待檢樣品分別用生理鹽水稀釋成1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700、1∶800、1∶900、1∶1 000，1∶1 100。其次用微量移液器依次從每個稀釋度中移取30 μL到微孔板的第1～11孔中，第12孔加30 μL生理鹽水作空白對照。搖勻雞血紅細胞，然后在每孔中各加入30 μL 1%雞血紅細胞（注意吸取量要準確，要懸空滴入以免拖帶），并于振蕩器上混勻2 min，最后水平靜置于室溫環境中，待空白對照孔發生完全沉集時讀取血凝價，以50%凝聚孔的稀釋度為該樣品的血凝價，9組試驗的血凝價見表2。

2 結果與分析

由表3、4可知，后孵化濕度對疫苗滴度影響最大，照蛋時間間隔次之，溫度影響最小。最佳生產方式應該是后孵化濕度55%，照蛋時間間隔2 h，后孵化溫度36 ℃。用該試驗方案生產疫苗可使疫苗血凝價比原來（1∶256）高很多，并且可達到制作高效濃縮苗的標準。對9組死亡雞胚進行胚體觀察，發現大部分胚體都出現典型的出血病變，特別是喙部兩側、頸部、翅部邊緣、腳部末梢等部位，小部分有腦炎癥狀。

3 結論與討論

（1）本試驗采用簡便的血凝試驗間接驗證疫苗的滴度是可行的，因為新城疫病毒的HN蛋白能結合雞血紅細胞，血凝能力與病毒含量成正比[6]。血凝價反映的是病毒的含量，而雞胚測毒反映的是活病毒含量。眾多資料表明，血凝價與雞胚測毒測出的滴度成正相關關系[7]。

（2）經查閱相關生產記錄發現，新城疫病毒在高溫高濕并且沒有活細胞可供生長繁殖的條件下，病毒的自身降解速度很快。因此，縮短照蛋時間間隔可及時將死胚挑出，放置在干燥低溫環境中，能較好保護病毒的穩定性。若后孵化濕度較低，胚體中的水分會有部分蒸發，有濃縮病毒的效果，但這樣會導致胚液量的減少，可能會影響胚液收獲量。筆者采用生物統計學中的方差分析法得出的結論與相關生產記錄相符，但還有一些問題如種毒的稀釋倍數調節、蛋的死亡時間控制等有待進一步研究和解決[8]，從而提高疫苗的效價。

（3）試驗發現，接種后72 h的死胚及接種后96 h的活胚的血凝價比其他時段死胚的血凝價高，其中原理尚不明確。針對雞胚接種后雞胚的生長及病毒的繁殖規律等問題還需作進一步研究。

（4）本次試驗僅從后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素對提高疫苗效價從而提高疫苗的質量進行初步探索，深層次的論證試驗有待今后進一步進行。

4 參考文獻

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997：736-750.

[2] 蔡寶祥.家畜傳染病學[M].4版.北京：中國農業出版社，2005：304-309.

[3] 哈爾濱獸醫研究所，中國農業科學院.動物微生物學[M].北京：中國農業出版社，1998：415-417.

[4] 李慧姣，蔣桃珍，李啟紅，等.雞新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗與血清學（HI）試驗的平行關系研究[J].中國獸醫雜志，2004（8）：5-8.

[5] 李康然.雞新城疫免疫中存在的一些問題[C]//中國畜牧獸醫學會禽病學分會第八次學術討論會論文集.青島：中國畜牧獸醫學會禽病學分會，1996：67-70.

[6] 陳一兵.非典型新城疫的發生機理與對策[J].養禽與禽病防治，1999（2）：13-14.

[7] 中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程（2000年版）[A/OL].（2014-12-24）[2018-05-21].https：//wenku.baidu.com/view/8e65ef92c8d376eeaeaa31ba.html.

[8] 劉國英，劉飛，鄭向陽，等.雞新城疫常規免疫接種途徑的血凝抗體監測實驗[C]//中國畜牧獸醫學會生物制品學分會第十二次學術研討會論文集.廣州：中國畜牧獸醫學會生物制品學分會，2005.