與熱誘導的光形態(tài)建成和生物鐘元件靶向結(jié)合的miRNA篩選與分析

屠小菊　汪啟明　黃錦周

摘要 隨著農(nóng)作物高溫熱害日益嚴重，廣泛篩選耐熱相關(guān)miRNA和深入了解植物的耐熱信號傳導對保證農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要的意義。通過miRbase等生物信息網(wǎng)站，篩選到多個可能與表達受熱脅迫調(diào)控的光信號元件和生物鐘基因存在潛在靶向關(guān)系的miRNA，這些結(jié)果為深入了解調(diào)控植物耐熱的分子機制奠定了基礎。

關(guān)鍵詞 熱誘導；光形態(tài)建成；生物鐘；miRNA

中圖分類號 Q781 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）20-0001-02

Abstract With the increasing heat damage of crops，it is important to screen heat-tolerant miRNA and understand heat-tolerant signal transduction to ensure the quality and yield of crops.Several miRNA that may have potential targeting relationships with the expression of light-signaling elements and bioclock genes regulated by heat stress have been screened through bioinformatics websites such as miRbase.These results lay a foundation for further understanding the molecular mechanism of regulating plant heat tolerance.

Key words heat induced；photomorphogenesis；biological clock；miRNA

基于小分子RNA是基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，在生物的生長發(fā)育和響應脅迫方面起著至關(guān)重要的作用[1]。在這些小分子RNA中，有一類內(nèi)源非編碼的，由20～24個核苷酸組成的小分子RNA稱為microRNAs（miRNAs）。miRNAs最初是由具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本衍生而來。miRNAs通過介導mRNA的降解或翻譯的抑制，作為重要的調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。現(xiàn)有研究表明，植物中成熟的miRNAs通過廣泛的互補，直接剪切它們的靶標mRNA，不僅在葉片發(fā)育、開花時間、器官極性和生長素信號傳遞等發(fā)育過程中發(fā)揮著決定性的作用[3]，而且在植物適應抗菌、硫酸鹽或磷酸鹽缺失、冷、干旱、鹽、紫外光輻射、重金屬和過氧化氫脅迫等各種各樣的生物和非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要的作用[4]。植物體內(nèi)的HSF介導的信號傳遞網(wǎng)絡與上述信號途徑有著密切的聯(lián)系，存在著多個共同調(diào)控元件[5]。近年，Schmollinger等試驗證明，人工構(gòu)建的miRNA系統(tǒng)能夠抑制萊茵衣藻中的HSF1的表達，從而調(diào)控衣藻自身的耐熱性[6]。由此推測miRNAs可能在水稻響應熱脅迫的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

在miRbase網(wǎng)站利用該網(wǎng)站自帶的blastN比對檢索系統(tǒng)，將在TAIR和KOME中搜索的靶基因cDNA序列按照種屬查找，查找靶基因?qū)膍iRNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 與熱誘導的光形態(tài)建成和生物鐘元件靶向結(jié)合的miRNA篩選

本課題組前期篩選到18個與耐熱相關(guān)的光形態(tài)基因以及10個與耐熱相關(guān)的生物鐘基因。基于miRNA在植物生長發(fā)育和適應環(huán)境過程中基因表達的重要調(diào)控作用，為全面了解與光信號和生物鐘相關(guān)元件存在靶向關(guān)系的miRNA，本研究首先利用miRBase網(wǎng)站查詢與光形態(tài)建成基因存在靶向關(guān)系的miRNA，得到的miRNA結(jié)果如表1所示。然后利用plantgrn網(wǎng)站，分析了與篩選出來的水稻生物鐘相關(guān)基因存在靶向關(guān)系的miRNA，結(jié)果如表2所示，共發(fā)現(xiàn)有5個水稻基因存在靶向結(jié)合的miRNA。

2.2 與熱誘導的光形態(tài)建成和生物鐘元件靶向結(jié)合的miRNA分析

不同miRNA抑制基因表達的方式不同，有的是抑制mRNA穩(wěn)定性，有的是在轉(zhuǎn)錄水平上進行抑制。對篩選出的miRNA及其靶基因的功能做了初步分析，發(fā)現(xiàn)miR5021的靶基因有SPA1、SPA4、HY4、CUL4、PIRL1。其中SPA1、SPA4都是編碼SPA蛋白家族的編碼基因，而SPA蛋白的N端含有一個絲氨酸或蘇氨酸的類激酶基序，其后跟著一個coiled-coil結(jié)構(gòu)和一個正電荷WD重復區(qū)域[7]。SPA蛋白是PHY信號途徑中的一員，參與光形態(tài)建成的光反應阻遏，起調(diào)節(jié)PHY信號途徑的作用，HY4是藍光受體[8]。miR5021又參與植物雄配子發(fā)育，植物耐熱的重要表型就是高溫下配子仍能正常發(fā)育。由此推測，miR5021與HY4、SPA1以及SPA4有可能形成一個新的調(diào)控復合體，影響光、溫信號對植物耐受高溫的表型。

miR838是由DCL1基因的內(nèi)含子14所編碼，可能通過從前體mRNA中形成miR838而自動調(diào)節(jié)DCL1基因的表達[9]。而DCL1編碼Dicer homolog。Dicer酶是一種作用于miRNA加工的RNA螺旋酶，它的突變能導致胚胎死亡[10]。對比miR838可能作用的靶基因HY4和PIRL1可以發(fā)現(xiàn)，HY4和PIRL1基因啟動子區(qū)域都具有LTR元件，并且受冷誘導表達高效。由此推測，寒冷環(huán)境能促使miR838高效表達，從而導致DCL1產(chǎn)生突變，并且作用于HY4和PIRL1，阻遏其耐寒元件表達。此外，已有文獻報道，與miR838存在靶向關(guān)系的AT1G18880在根韌皮部的伴細胞編碼一個低親和力質(zhì)膜硝酸鹽轉(zhuǎn)運體[11]。

對miR773b的分析發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中miR773b除以COP9為靶標外，還可與AT1G03080.1、AT1G25682.1、AT1G27410.1等存在靶向關(guān)系。其中AT1G03080.1編碼激酶互作家族蛋白質(zhì)[12]，并在胚胎成熟期高效表達；AT1G25682.1編碼蛋白質(zhì)，但其功能不明；AT1G27410.1編碼DNA修復內(nèi)酰胺酶家族蛋白，同樣在胚胎成熟過程高效表達。由此推測，MIR773的功能與胚胎成熟有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

通過miRbase等生物信息網(wǎng)站，篩選到多個可能與表達受熱脅迫調(diào)控的光信號元件和生物鐘基因存在潛在靶向關(guān)系的miRNA，其中MIR5021、MIR838、MIR773b可能參與植物種子胚胎發(fā)育過程中熱激信號通路，MIR837可能參與編碼轉(zhuǎn)運因子基因調(diào)控，MIR414可能參與逆境誘導。其余miRNA在光溫信號途徑中的作用待進一步研究。雖然能初步闡明部分miRNA在植物光、溫信號通路中的作用，但具體作用機制仍處于推測階段。每一個miRNA具體屬于上述哪種功能方式，和通過調(diào)控哪個基因的表達而參與植物耐熱的信號調(diào)控網(wǎng)絡，將有待于對相關(guān)miRNA進一步研究。

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