趨化因子CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞RANKL表達(dá)的影響

金晟宇，任紅革

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

趨化因子CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞RANKL表達(dá)的影響

金晟宇，任紅革

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

目的探討趨化因子CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)表達(dá)的影響。方法①體外培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，并給予10 μg/mL TNF-α處理，分別在培養(yǎng)0、6、12、24 h時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)CXCL13表達(dá)。②人滑膜細(xì)胞給予10 μg/mL TNF-α處理24 h，將培養(yǎng)液更換為含0、5、10、25 ng/mL CXCL13的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，或?qū)⑴囵B(yǎng)液更換為含25 ng/mL CXCL13的培養(yǎng)液分別作用0、1、3、6、24 h；以不加TNF-α及CXCL13處理的常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。收集各濃度、各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果①TNF-α作用0、6、12、24 h時(shí)細(xì)胞CXCL13相對(duì)表達(dá)量(熒光強(qiáng)度)分別為0.907±0.350、0.823±0.730、0.710±0.660、0.653±0.850，組間比較P均<0.05。②對(duì)照細(xì)胞RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.956±0.014，25 ng/mL CXCL13處理0、1、3、6、24 h時(shí)RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.543±0.047、1.366±0.026、0.883±0.026、0.367±0.034、0.246±0.015；0、5、10、25 ng/mL CXCL13作用24 h時(shí)RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.287±0.007、0.189±0.008、0.069±0.004、0.022±0.002；上述各組、各時(shí)間及各濃度細(xì)胞比較P均<0.05。結(jié)論趨化因子CXCL13能夠在一定濃度和時(shí)間內(nèi)抑制TNF-α誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)。

骨關(guān)節(jié)炎；趨化因子CXCL13；腫瘤壞死因子α；細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體；人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞

骨關(guān)節(jié)炎是一種由復(fù)雜病因?qū)е碌穆酝诵行约膊。址Q退行性骨關(guān)節(jié)炎，通常累及全身負(fù)重較大的關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，降低關(guān)節(jié)的使用壽命[1]。趨化因子CXCL13在骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織低表達(dá)可能引起細(xì)胞因子分泌失衡，加重炎癥反應(yīng)[2]。調(diào)控細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)又稱骨保護(hù)素配體，在破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、激活中扮演關(guān)鍵角色[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中誘導(dǎo)CXCL13表達(dá)可上調(diào)RANKL水平[4]。TNF-α是誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的細(xì)胞因子，通過持續(xù)活化細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[5]。2015年10月～2016年10月我們進(jìn)行本研究，探討趨化因子CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞RANKL表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司。TNF-α、CXCL13(英國(guó)R&DSystems)，Anti-CXCL13兔多克隆抗體(英國(guó)Abcam)，Anti-RANKL兔多克隆抗體(美國(guó)Sigma-Aldrich)，靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡(北京萊卡儀器有限公司)，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂BIO-RAD技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將滑膜細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3 TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞CXCL13表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。將細(xì)胞消化，調(diào)整密度為1.0×105個(gè)/mL接種于6孔板，分別加入含10 μg/mL TNF-α的培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)0、6、12、24 h時(shí)取出部分玻片，PSB清洗，多聚甲醛固定，Triton X-100處理15 min，加入小牛血清(BSA)封閉30 min；加入CXCL13一抗，4 ℃過夜；洗去一抗，加熒光二抗孵育5 min；用含DAPI抗熒光封片劑封片，熒光顯微鏡分析。

1.4 CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞RANKL表達(dá)的影響 采用Western blotting法。將細(xì)胞消化，調(diào)整密度為1.0×105個(gè)/mL接種于6孔板，置于含10 μg/mL TNF-α培養(yǎng)液處理24 h，將培養(yǎng)液更換為含0、5、10、25 ng/mL CXCL13的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，或?qū)⑴囵B(yǎng)液更換為含25 ng/mL CXCL13的培養(yǎng)液分別作用0、1、3、6、24 h；收集各濃度、各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，PBS洗滌，Bradford法進(jìn)行蛋白定量；取30 μg蛋白與5×SDS加樣緩沖液混合，95 ℃變性5 min；經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜；洗去一抗，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗，反應(yīng)2 h；采用Image J測(cè)定各蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。以不加TNF-α及CXCL13處理的常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α誘導(dǎo)對(duì)滑膜細(xì)胞CXCL13表達(dá)的影響 CXCL13主要定位于滑膜細(xì)胞的細(xì)胞核中，在顯微鏡下呈微弱的綠色熒光。在加入TNF-α刺激后，細(xì)胞質(zhì)中的綠色熒光強(qiáng)度減弱，且隨著TNF-α刺激時(shí)間延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸下調(diào)。TNF-α刺激0、6、12、24 h時(shí)細(xì)胞CXCL13相對(duì)表達(dá)量(熒光強(qiáng)度)分別為0.907±0.350、0.823±0.730、0.710±0.660、0.653±0.850，組間比較P均<0.05。

2.2 CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞RANKL表達(dá)的影響 對(duì)照細(xì)胞RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.956±0.014。25 ng/mL CXCL13處理0、1、3、6、24 h時(shí)RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.543±0.047、1.366±0.026、0.883±0.026、0.367±0.034、0.246±0.015；0、5、10、25 ng/mL CXCL13作用24 h時(shí)RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.287±0.007、0.189±0.008、0.069±0.004、0.022±0.002；上述各組各時(shí)間點(diǎn)、各濃度細(xì)胞間比較P均<0.05。見圖1、2。

注：con指對(duì)照細(xì)胞；其余條帶為TNF-α、CXCL13處理細(xì)胞。

圖125ng/mLCXCL13作用0、1、3、6、24h時(shí)細(xì)胞RANKL表達(dá)電泳圖

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生、發(fā)展是由多種細(xì)胞因子通過不同的作用機(jī)制相互作用、相互影響而形成的復(fù)雜過程。細(xì)胞因子在關(guān)節(jié)中結(jié)構(gòu)和功能的改變可引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的病理變化，加重臨床癥狀[6,7]。檢測(cè)骨關(guān)節(jié)炎患者血液、關(guān)節(jié)液中各種因子的表達(dá)水平、分泌機(jī)制，可以為明確骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制、判斷臨床進(jìn)展提供幫助。關(guān)節(jié)滑膜是覆蓋在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的疏松結(jié)締組織，具有清除吞噬、分泌制造滑液和調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)滑液等作用[8]。越來越多的研究表明，滑膜炎癥的出現(xiàn)是多種細(xì)胞因子異常分泌的結(jié)果，且滑膜炎可引起軟骨結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)一步加重臨床癥狀。

注：con指對(duì)照細(xì)胞；其余條帶為TNF-α、CXCL13處理細(xì)胞。

圖20、5、10、25ng/mLCXCL13作用24h時(shí)細(xì)胞RANKL表達(dá)電泳圖

CXCL13又稱B淋巴細(xì)胞趨化因子(BLC)或B細(xì)胞吸附因子1(BCA-1)，對(duì)B淋巴細(xì)胞具有顯著的吸附作用[9]，屬于趨化因子CXC亞族中的一種。CXCL13是由異位淋巴細(xì)胞生發(fā)中心的濾泡樹突狀細(xì)胞分泌，并不是由巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞分泌聚集，在骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中CXCL13表達(dá)下降。這種CXCL13異常分泌造成B淋巴細(xì)胞在濾泡樹突狀細(xì)胞附近異常聚集，從而導(dǎo)致慢性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展[10]。有報(bào)道稱，CXCL13可以促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白[11]。Ⅰ型膠原蛋白是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成部分，在構(gòu)造及維持軟骨組織框架過程中扮演重要角色，能夠保護(hù)及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，預(yù)防各種原因引起的關(guān)節(jié)炎癥。本研究結(jié)果顯示，TNF-α處理的滑膜細(xì)胞中CXCL13表達(dá)明顯低于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果一致[2]。骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中CXCL13過低表達(dá)，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步影響整個(gè)關(guān)節(jié)內(nèi)部的細(xì)胞因子微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌失衡，造成相關(guān)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展。本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)將趨化因子CXCL13作為誘導(dǎo)劑，人為提高細(xì)胞環(huán)境中CXCL13濃度，觀察CXCL13對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行處理，檢測(cè)其是否可引起相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化發(fā)揮抑制骨關(guān)節(jié)炎癥的作用。

RANKL又稱骨保護(hù)素配體(OPGL)，是TNF超家族成員之一，可以促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，加強(qiáng)骨骼吸收。RANKL通過與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞模表面調(diào)控細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合，促使破骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步激活骨吸收活性。RANKL過度上調(diào)會(huì)導(dǎo)致骨骼改建，引起骨性疾病[12，13]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌骨浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL13可以上調(diào)RANKL表達(dá)[13]；對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌骨浸潤(rùn)的骨母細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞給予CXCL13激活劑c-Myc刺激，亦可以上調(diào)RANKL表達(dá)[14]。但本研究顯示出不同結(jié)果，TNF-α誘導(dǎo)正常關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞建立的細(xì)胞炎癥模型中RANKL表達(dá)上調(diào)，RANKL異常高表達(dá)導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜中相應(yīng)細(xì)胞因子微環(huán)境失衡，通過特異性細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞分化，控制基因表達(dá)，進(jìn)一步抑制破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨骼重建與吸收失去動(dòng)態(tài)平衡。

本研究采用TNF-α建立細(xì)胞炎癥模型后，應(yīng)用趨化因子CXCL13對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)隨著CXCL13作用時(shí)間延長(zhǎng)，RANKL表達(dá)逐漸降低；隨著CXCL13刺激濃度增加，RANKL表達(dá)量亦逐漸降低。上述結(jié)果提示，CXCL13對(duì)炎癥模型中RANKL表達(dá)有明顯的抑制作用。在對(duì)細(xì)胞給予濃度為25 ng/mL的CXCL13作用后，RANKL表達(dá)明顯降低，我們考慮過高濃度的CXCL13可能引起某條信號(hào)通路關(guān)閉，造成表達(dá)失調(diào)。本研究結(jié)果與前期研究[12～14]結(jié)果不同，可能與以下原因有關(guān)：研究對(duì)象的細(xì)胞種類、細(xì)胞株、細(xì)胞分化階段不同，其對(duì)外界刺激的反應(yīng)能力也有所不同；在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，既往實(shí)驗(yàn)大多針對(duì)CXCL13對(duì)某種細(xì)胞的單獨(dú)作用，本研究是在TNF-α誘導(dǎo)建立炎癥模型后利用CXCL13對(duì)模型進(jìn)行刺激，探討這幾種因子之間可能存在相互影響，產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用。

綜上所述，CXCL13可在一定濃度和時(shí)間內(nèi)抑制TNF-α誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)，該作用呈一定的濃度和時(shí)間依賴性。

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InfluenceofCXCL13onexpressionofRANKLinhumansynovialcellsinducedbyTNF-α

JINShengyu,RENHongge

(YanbianUniversityHospital,Yanji133000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of CXCL13 on the expression of receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) in human synovial cells induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α).Methods① The human synovial cells were cultured in vitro and were treated with 10 g/mL TNF-α. At 0, 6, 12, and 24 h, we used immunofluorescence to detect the CXCL13 expression. ② The human synovial cells cultured in vitro were treated with 10 g/mL TNF-α for 24 h, after that, we replaced the culture fluid with medium containing 0, 5, 10, and 25 ng/mL CXCL13 and continued to culture for 24 h, or replaced the culture fluid with medium containing 25 ng/mL CXCL13 and continued to culture for 0, 1, 3, 6, and 24 h. The relative expression of RANKL was detected by Western blotting. The normal cultured cells without treatment of TNF-α and CXCL13 were used as the control group.Results①The expression levels of CXCL13 (fluorescence intensity) were 0.907±351, 0.823±735, 0.710±664, and 0.653±853 in cells treated with TNF-α at 0, 6, 12, and 24 h (allP<0.05). ②The expression of RANKL protein was 0.956±0.014 in the control group, and the expression levels of RANKL protein in cells treated with 25 ng/mL CXCL13 for 0, 1, 3, 6, and 24 h were 1.543±0.047, 1.366±0.026, 0.883±0.026, 0.367±0.034, and 0.246±0.015; the expression levels of RANKL protein in cells treated with different contentrations (0, 5, 10, 25 ng/mL) of CXCL13 were 0.287±0.007, 0.189±0.008, 0.069±0.004, and 0.022±0.002; significant difference was found between them (allP<0.05).ConclusionCXCL13 can inhibit the expression of RANKL protein of osteoarticular synovial cells induced by TNF-α in a certain concentration and time.

osteoarthritis; chemokine CXCL13; tumor necrosis factor-α; receptor activator of NF-κB ligand (RANKL); human synovial cells

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究“十二五”規(guī)劃課題資助項(xiàng)目(吉教科合字201310)。

金晟宇(1990-)，男，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)楣顷P(guān)節(jié)疾病。E-mail: jinshy0923@hotmail.com

任紅革(1975-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楣顷P(guān)節(jié)疾病。E-mail: renhg196@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.002

R684.3

A

1002-266X(2017)48-0005-04

2017-04-29)