咖啡因對早期胚胎及卵黃膜發育的影響

高原 鄒鵬

[摘要] 目的 初步探索研究妊娠期婦女攝入咖啡因，對胎兒發育速度所造成的影響，以及其發生的機制。 方法 該研究在2016年5月—2017年6月以雞胚為實驗模型，分為正常組（PBS）、低劑量組（4 μmol/egg）、中劑量組（8 μmol/egg）、高劑量組（16 μmol/egg）。新鮮種雞蛋分組后37℃孵化2 d，在蛋殼上開窗，給予不同劑量的咖啡因，繼續培養6 d后取出胚胎固定。隨后根據需要進行形態學與分子學方面的分析胚胎發育的變化。 結果 各個組別的卵黃膜形態發育明顯不同，H.E染色可以進一步證實，并且p185 RT-PCR的表達明顯受到影響，卵黃膜組織的細胞增殖和凋亡也出現了明顯變化并出現凋亡。 結論 妊娠期婦女早期大劑量的攝入咖啡因，通過影響胎盤絨毛的發育影響營養物質的吸收從而影響到胚胎的正常發育。

[關鍵詞] 咖啡因；胚胎；卵黃囊；胎盤

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）09（b）-0029-03

[Abstract] Objective To explore the effects of caffeine intake in pregnant women on the developmental speed of the fetus and its mechanism. Methods In this study， chicken embryos were used as experimental models from May 2016 to June 2017. They were divided into normal group （PBS）， low dose group （4 μmol/egg）， medium dose group （8 μmol/egg）， high dose group （16 μmol/egg）. Freshly bred eggs were incubated at 37 °C for 2 days， and windows were opened on the eggshells， and different doses of caffeine were administered. After 6 days of culture， the embryos were removed and fixed. Morphological and molecular aspects of subsequent changes in embryonic development were then performed as needed. Results The morphological development of yolk membrane was significantly different in each group. H.E staining could be further confirmed， and the expression of p185 RT-PCR was significantly affected. The cell proliferation and apoptosis of yolk membrane tissue also showed obvious changes and apoptosis. Conclusion Early intake of large doses of caffeine in pregnant women affects the normal development of embryos by affecting the development of nutrients in the development of placental villi.

[Key words] Caffeine； Embryos； Yolk sac； Placenta

出生時體重低于2 500 g，身長低于45 cm，孕周少于37周的新生兒稱為低體重兒。低體重兒出生后由于皮下脂肪少，保溫能力差，呼吸機能和代謝機能都比較弱，造成其死亡率較正常的新生兒高出很多，同時也會造成其智力發育方面的影響[1-2]。瑞典薩爾格林斯卡大學醫院的研究小組在最新一期《BMC醫學》雜志上發表論文指出，妊娠期婦女飲用咖啡可能導致孕期延長和造成低體重兒的風險增加。因此，研究者呼吁對孕期咖啡因推薦攝入量做出相應調整，深入研究咖啡因對胚胎發育的影響，不僅有治療學意義，還能為生活保健提供科學的指導[3-5]。該研究在2016年5月—2017年6月選取新鮮的種蛋，每組20只共80只，探討咖啡因對早期胚胎及卵黃膜發育的影響效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

種蛋：華南農業大學； 咖啡因：Sigma； 甲醛：天津化學試劑廠；P185引物：賽默飛。

1.2 胚胎的培養

橫向孵化種蛋2 d，分組為：正常組（PBS）、低劑量組（4 μmoL/egg）、中劑量組（8 μmoL/egg）、高劑量組（16 μmoL/egg），隨后開窗給予咖啡因，重新封閉蛋殼，繼續培養6 d后取出雞胚和卵黃膜，雞胚進行胚胎體重的測量，卵黃膜局部拍照。

1.3 卵黃膜H.E染色

不同實驗組的卵黃膜通過4%PFA充分固定后，為了更好的保持組織形態使用四氫呋喃脫水，具體時間是：30%3 h，50%3 h，70%2 h，85%2 h，90%1.5 h，95%I1 h，95%II 1 h，100%I 1 h，100%II 1 h，所有組織常規石蠟包埋，在包埋時把握方向，以獲得卵黃囊血管的橫切面；H.E染色觀察組織形態方面的發育狀態。

1.4 RT-PCR

Reverse Transcription-PCR是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。不同實驗組的卵黃膜在取材時一部分用4%PFA固定，另外一部分需要加Trizol -80℃冰箱保存備RT-PCR。對吸收轉運蛋白調控基因p185進行檢測，觀察咖啡因暴露對各組的表達差異情況。

1.5 組蛋白H3（PH3）以及凋亡標記物TUNEL的免疫熒光

通過形態學觀察，胚胎隨著暴露咖啡因劑量的增加，卵黃膜的組織形態受到了影響，轉運營養的能力也受到了損傷，為了了解其發生發展的原理，對卵黃膜組織進行了細胞增殖和凋亡的檢測。從卵黃囊細胞增殖分化的方向去分析其發育差異的原因：卵黃膜組織經4%PFA充分固定后，3%BSA封閉2 h，加一抗PH3（1：200） ，TUNEL（1：200）4℃冰箱過夜，PBS沖洗10 min×3，加二抗pH3（555） ，TUNEL（488），冰凍切片進行拍照觀察。

1.6 統計方法

通過SPSS 17.0統計學軟件分析數據，計量資料（x±s）和計數資料[n（%）]分別采用t檢驗和χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胚胎長度的統計分析

單因素方差分析，正常組與中劑量組差異有統計學意義（P<0.05），正常組與高劑量組差異有統計學意義（P<0.01），見圖1。

2.2 卵黃膜形態變化、RT-PCR

不同實驗組的卵黃膜通過充分固定后石蠟切片、H.E染色后可以觀察到各個實驗組在組織形態方面的發育狀態存在著明顯的差異，同時不同實驗組的卵黃膜的p185基因的RT-PCR的結果顯示隨著濃度的增高有降低的趨勢，見圖2。

2.3 卵黃膜組織細胞增殖凋亡的變化

通過實驗結果顯示：胚胎隨著暴露咖啡因劑量的增加，卵黃膜的組織的細胞增殖能力減弱，與其相反其凋亡程度增加，從細胞增殖凋亡方面解釋了胚胎發育受到影響的原因，見圖3。

3 討論

咖啡因（ caffeine）化學名為 1， 3， 7三甲基黃嘌呤， 又稱三甲基黃嘌呤，是一種中樞神經興奮劑。由于咖啡因可以促進新陳代謝、開胃促消化，并且具有提神和減輕疲勞等功效，使得含咖啡因的飲食產品倍受人們喜愛。與此同時，一些含有咖啡因的非處方藥在市面上也非常常見，但是孕期攝入過多咖啡因可引起母體血流動力學的異常改變進而直接影響胎盤和胎兒的發育[6-8]。有研究顯示，咖啡因可導致神經胚期雞胚發育缺陷，高劑量還可影響神經脊細胞的分布于遷移[9]。

該課題研究結果顯示，隨著暴露咖啡因劑量的增加，該課題發現隨著咖啡因劑量的增加，胚胎重量顯著降低。低劑量組胚胎重量，與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05），中劑量的體重與正常組差異有統計學意義（P<0.05），高劑量組的體重與正常組差異有統計學意義（P<0.01），低劑量組與正常組差異無統計學意義（P>0.05），且存在劑量效應。HE染色結果顯示，卵黃膜的血管發育情況變差，同時轉運蛋白基因p185的表達隨著咖啡因劑量的上升而下降，免疫熒光染色顯示，高劑量組與對照組相比細胞增殖下降，細胞凋亡程度增加，細胞周期移植基因p21表達上升。這一系列改變影響了卵黃膜的血液循環，造成了營養物質的交換受到影響，從而影響胚胎的發育，使胚胎的重量隨著咖啡因的劑量增加而下降。目前關于這類研究極少，主要在于開展難度較大，國內缺乏相關的技術研究與探索，該次研究也是淺略分析與研究。不過，有研究對咖啡因和妊娠相關不良事件進行了研究，指出咖啡因攝入可能會造成新生兒低體重、流產等不良結局，建議妊娠后避免咖啡因攝入，但也不必完全禁止。

選擇雞胚為實驗模型優點，首先是雞胚是大家熟知的傳統的一種生物學模型，其次資源相對豐富、價格實惠、操作簡單、實驗周期短等等。卵黃囊形成于胚胎孵育的第2天，然后逐漸包圍蛋黃，在孵育的第九天時將整個蛋黃包裹起來。卵黃囊延卵黃膜發生，其上密布血管，卵黃囊的作用是呼吸、營養和造血。卵黃囊可為胚胎孵育的前6 d提供氧氣；蛋黃內的營養物質被卵黃囊內皮層細胞分泌的消化酶類分解為液狀，并由卵黃內壁吸收，然后通過卵黃血液循環將營養運送到胚胎供胚胎發育使用；卵黃囊內壁在孵化初期形成血島，然后進一步分化成血管內皮層和原始的血球，因此卵黃囊是胚胎發育的呼吸器官、營養器官和造血器官，對胚胎的發育起到至關重要的作用。在胚胎早期發育的過程中，卵黃囊收到任何不良因素影響，都會對胚胎發育造成不良的后果[10-12]。

在我國，含咖啡因的產品消耗量也在逐年增加，且妊娠婦女攝入含咖啡因的飲品、食物和藥物的現象也越來越常見。妊娠期婦女長期攝入咖啡因，咖啡因通過胎盤屏障進入胎兒體內，對胎兒神經系統發育會造成什么樣的不良影響，具體的表現如何，其發生的分子機制至今尚無定論，國內外的相關報道也較少，所以值得對其進行深入研究，從而對妊娠期婦女安全而且合理的飲食提供科學的依據，實現所倡導的優生優育、提高人口素質的目的，具有重要的倫理價值和現實指導意義。

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（收稿日期：2018-06-12）