甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達及臨床意義

權明明+++++++陳珍珍+++++++戴岳楚++++++梁勇

[摘要] 目的 研究FHL1蛋白和FHL1基因在甲狀腺癌中的表達及臨床意義。 方法 分別應用實時定量PCR、蛋白質雜交檢測人甲狀腺乳頭狀癌組織標本及結節性甲狀腺腫標本中FHL1基因和蛋白的表達情況。 結果 實時定量PCR提示FHL1基因在結節性甲狀腺腫中高表達，在甲狀腺乳頭狀癌中低表達，相對表達量為（0.4538±0.0074），差異有統計學意義（P<0.05）；蛋白質雜交提示FHL1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中低表達（0.4033±0.0296），在結節性甲狀腺腫中高表達（0.8021±0.0269），差異有統計學意義（P<0.05）。在PTC組中，女性FHL1的陽性表達率為41.4%，男性FHL1的陽性表達率為36.4%，有頸部淋巴結轉移的FHL1陽性表達率為42.9%。 結論 FHL1蛋白和FHL1基因在甲狀腺乳頭狀癌中均低表達，提示在甲狀腺乳頭狀癌中FHL1可能起抑制癌細胞的作用。

[關鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌；FHL1基因；FHL1蛋白；抑癌基因

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）32-0005-03

[Abstract] Objective To study the expression and clinical signifiance of FHL1 protein and FHL1 gene in thyroid carcinoma. Methods Real-time quantitative PCR and protein hybridization were used to detect the expression of FHL1 gene and protein in papillary thyroid carcinoma specimens and nodular goiter specimens. Results Real-time quantitative PCR indicated that FHL1 gene was highly expressed in nodular goiter， and lowly expressed in papillary thyroid carcinoma. The relative expression amount was（0.4538±0.0074）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）； protein hybridization suggested that FHL1 protein was lowly expressed in papillary thyroid carcinoma（0.4033±0.0296）， and was highly expressed in nodular goiter（0.8021±0.0269）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）. In PTC group， the positive expression rate of FHL1 was 41.4% in females， and the positive expression rate of FHL1 was 36.4% in males. The positive expression rate of FHL1 in cervical lymph node metastasis was 42.9%. Conclusion FHL1 protein and FHL1 gene are lowly expressed in papillary thyroid carcinoma， suggesting that FHL1 may play a role in inhibiting cancer cells in papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma； FHL1 gene； FHL1 protein； Cancer suppressor gene

近年來，全球大宗臨床數據分析顯示甲狀腺癌尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）發病率逐年增高，其發病率占甲狀腺癌的90%以上，尤以女性發病率高最為常見，對其發病機理及機制研究也是目前研究的熱點之一。本研究旨在探討FHL1基因和甲狀腺乳頭狀癌發病的內在機制，FHL1（four and half LIM domain protein 1）基因是近年人類發現的一種抑癌基因，在Src和Cas信號通路下游特異性抑制腫瘤細胞的生長和轉移。在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、腎癌中均表達，并且表達是下降的，研究發現其在多種惡性腫瘤發病機制中扮演抑癌基因角色。本文從基因和蛋白方面研究甲狀腺乳頭狀癌FHL1的表達情況，為甲狀腺乳頭狀癌的具體發病機制提供微觀生物學證據。

1資料與方法

1.1 一般資料

組織樣本：選自浙江省臺州市中心醫院腫瘤外科2016年1～12月期間的手術切除組織標本。實驗組（PTC組）甲狀腺乳頭狀癌40例，男11例，女29例，年齡29～59歲，平均44.3歲。對照組為結節性甲狀腺腫40例，男10例，女30例，年齡32～62歲，平均45.2歲。標本體積約5 mm×5 mm×5 mm，重約0.5 g，所有標本病理均經過病理學證實，并且取材經過患者及其家屬同意，所有標本留取后于30 min內放置于-80℃冰箱保存備用。

主要試劑及儀器：垂直電泳槽及轉膜槽、RNA提取試劑盒、Quant cDNA合成試劑盒、兔抗人FHL1抗體、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒、DAB顯色試劑盒、Stepone PCR儀。endprint

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR方法 PCR引物序列（FHL1基因）見表1。提取新鮮的甲狀腺乳頭狀癌及結節性甲狀腺腫標本各40例，每例樣本重約0.2 g，采用Trizol法提取組織中總的RNA，并且測定RNA提取的濃度及純度，證明提取的RNA完整。cDNA合成（20 μL反應體系）：反應采用20μL反應體系，依據說明書依次加入試劑，在37℃水浴中放置60 min。參照試劑盒說明完成Real-time PCR。

1.2.2 Western-blotting方法 取出新鮮的甲狀腺乳頭狀癌和對照組標本，每組均40例，每例約0.2 g，按照說明書提取組織蛋白，然后測定總蛋白濃度，配置電泳所需的濃縮膠和分離膠，每個小孔的用量是50 μg，基準Marker為5 μL，100 V電泳，繼續15 V電壓，經過1 h后將膠移至硝基纖維膜上，然后脫脂奶粉脫脂2 h，滴加Ⅰ抗（FHL1抗體濃度1∶1000），置于4℃冰箱過夜，滴加Ⅱ抗（濃度為1∶5000）室溫靜置1.5 h，滴加發光液。

1.3 觀察指標

實時定量PCR觀察指標：收集溶解、擴增曲線，然后計算相對表達量；Western-blotting方法觀察指標：暗室內進行曝光顯影定影，最后軟件分析蛋白濃度灰度。

1.4 統計學方法

使用SPSS16.0軟件包對數據進行處理，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達

FHL1基因與GAPDH的PCR擴增曲線及溶解曲線提示無特異引物二聚體產生，單峰。使用該體系可以對FHL1基因在PTC組及對照組中的表達進行定量分析：結果計算方法采用2-ΔΔCt，FHL1 mRNA在對照組及PTC組均有表達，FHL1 mRNA在PTC組中的表達為對照組的（0.4538±0.0074），差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、2。

2.2甲狀腺乳頭狀癌中FHL1蛋白的表達結果（蛋白質雜交）

FHL1蛋白在PTC組中相對表達量是（0.4033±0.0296），在對照組中蛋白質相對表達量是（0.8021±0.0269），FHL1蛋白在PTC組低表達，在對照組高表達，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 FHL1蛋白表達與PTC臨床病理學參數

在PTC組中，年齡≥45歲的患者為30例，其中11例表達FHL1蛋白，陽性率為36.7%，年齡<45歲10例，其中4例表達FHL1蛋白，陽性率為40.0%；在PTC組中，男11例，其中4例表達FHL1蛋白，陽性率為36.4%，女29例，其中12例表達FHL1蛋白，陽性率為41.4%；頸部淋巴結轉移21例，其中9例表達FHL1蛋白，陽性率為42.9%，無頸部淋巴結轉移19例，其中8例表達FHL1蛋白，陽性率為42.1%；臨床分期為Ⅰ、Ⅱ共35例，其中14例表達FHL1，陽性率為40.0%，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ共5例，其中2例表達FHL1蛋白，陽性率為40.0%。

3討論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型之一，也是內分泌系統最常見的惡性腫瘤。近年來，其發病率逐年增高，對其發病機制的研究也日益成為熱點[1-4]。抑癌基因和原癌基因的表達比例失調目前認為是惡性腫瘤發生的機制之一[5]。我國北京市甲狀腺癌發病率在1995年為1.6/10萬，而在2010年為9.9/10萬，增長了518.8%[6]。同樣歐美國家的甲狀腺乳頭狀癌的發病率也是逐年增加的[7，8]。

FHL1的大小為32 kD，其基因位于染色體Xq26.3，FHL1參與細胞的信號傳導通路和基因轉錄的調節，在骨骼肌、心血管系統的分化和發育中起重要作用[9]。FHL1由4個半LIM結構域組成，LIM結構域可以和多種蛋白交互作用并參與細胞的增殖、分化、轉錄[10]。現有研究表明，FHLI蛋白對多種核糖體蛋白基因具有調控作用，FHL1參與細胞增殖分化、信號轉導等多種細胞活動，在多種腫瘤發生和發展中起重要作用[11，12]。FHL1還是轉錄抑制因子，同時顯示FHL1在多種組織中功能不同[13-15]。研究已證實FHL1在多種惡性腫瘤中存在表達，FHL1在多種惡性腫瘤中起抑癌基因的作用，是一種腫瘤抑制因子。FHL1在調節雌激素受體信號傳導和乳腺癌細胞的生長中起很重要的作用，通過與雌激素受體相互作用抑制乳腺癌細胞生長[16，17]。FHL1在絕大多數腺癌、肺癌組織中的表達明顯下調[18]。劉哲等[19]研究發現：FHL1蛋白在胰腺癌中低表達，并且這種低表達與胰腺癌的侵襲、轉移等密切相關。吳成利等[20]研究發現：FHL1在未分化胃癌中低表達，在高分化胃癌中高表達，并且隨著病理分期的增高其表達呈下降局勢，FHL1參與了胃癌的發生發展過程，是影響胃癌患者術后生存時間的獨立因子。

本研究結果證實PTC組中FHL1 mRNA的表達為對照組的（0.4538±0.0074），提示FHL1基因在PTC組低表達，在對照組中高表達。蛋白質雜交結果證實FHL1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌蛋白質的相對表達是（0.4033±0.0296），明顯低于對照組的（0.8021±0.0269），以上的數據經統計學處理，其差異均有統計學意義（P<0.05），從基因及蛋白層面本實驗證實FHL1基因及其蛋白在甲狀腺乳頭狀癌均低表達，推測該基因在甲狀腺乳頭狀癌中起抑癌基因作用。多項研究證實FHL1在胰腺癌、肺癌、胃癌中均出現低表達，推測FHL1在這些惡性腫瘤中起抑癌基因作用，與本實驗結果相似。

隨著分子生物學的發展，對各種惡性腫瘤的研究已經深入細胞、基因、蛋白層面，FHL1基因是一個近年發現的抑癌基因，已證實FHL1與乳腺惡性腫瘤、肝腫瘤、肺惡性腫瘤、直腸癌等發生密切相關。本實驗證實FHL1在甲狀腺乳頭狀癌發生發展中起抑癌作用，其內在的具體機制及其如何啟動FHL1基因是值得我們進一步研究的課題，深入探討甲狀腺乳頭狀癌中FHL1基因的表達情況，為后續甲狀腺其他病理類型腫瘤與該基因的研究指明方向。endprint

[參考文獻]

[1] Sipos JA，Mazzaferri EL. Thyroid cancer epidemiology and prognostic variables[J].Clin Oncol（Rcou Radiol），2010，22（6）：395-404.

[2] Enewold L，Zhu K，Ron E，et al.Rising thyroid cancer incidence in the United States by demographic and tumor characteristics，1980-2005[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18（3）：784-791.

[3] Kweon SS，Shin MH，Chung U，et al.Thymid cancer is the most common cancer in women，based on the data from population-based cancer registries，south Korea[J].Jpn J Clin Oncol，2013，43（10）：1039-1046.

[4] WHO. GLOBOCAN2012：Estimated cancer incidence，mortality and prevalence in 2012[EB/OL].[2013-12-31].http：//globocan.iarc.fr/Pages/fac_sheets_population.aspx.

[5] 任立軍，楊廷芳，張成雷.甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移規律的臨床研究[J].中國普外基礎與臨床雜志，2011，（4）：419-422.

[6] 楊雷，孫婷婷，袁延楠，等.1995-2010年北京城區甲狀腺癌發病趨勢及病理特征分析[J].中華預防醫學雜志，2013，47（2）：109-112.

[7] Davies L，Welch HG.Current thyroid cancer trends in the United States[J].JAMA Otolaryngol Head Neck Surg，2014，140（4）：317-322.

[8] Dal Maso L，Lise M，Zambon P，et al.Incidence of thyroid cancer in ltaly，1991-2005： Time trends and age-period-cohort effects[J].Ann Oncol，2011，22（4）：957-963.

[9] Mcgrath MJ，Cottle DL，Nguyen MA，et al.Four and a half LIM protein 1 binds myosin—binding protein C and regulates myosin filament fomaation and sarcomere assembly[J].J Biol Chem，2006，281（11）：7666-7783.

[10] Lin J，Ding L，Jin RJ，et al.Four and a half LIM domains 1（FHL1） and receptor interacting protein of 140kDa（RIP140） interact and cooperate in estrogen signaling[J].Int J Biochem Cell Biol，2009，41（7）：1613-1618.

[11] Rudra D，Zhao Y，Warner JR.Central role of the lfh1p-Fhl1p interaction in the synthesis of yeast ribosomal proteins[J].EMBO J，2005，24（3）：533-542.

[12] Shathasivam T，Kislinger T，Gramolini AO.Genes， proteins and complexes：The multifaceted nature of FHL family proteins in diverse tissues[J].J Cel1 Mol Med，2010，14（12）：2702-2720.

[13] 吳延升，張侖，王旭東，等.甲狀腺乳頭狀癌預后多因素分析[J].中國腫瘤臨床，2007，（22）：1294-1297.

[14] Martin DE，Soulard A，Hall MN.TOR regulates ribosomal protein gene expression via PKA and the Forkhead transcription factor FHL1[J].Cell，2004，119（7）：969-979.

[15] 李治，劉春萍，屈新才，等.乳頭狀甲狀腺癌的頸部淋巴結轉移規律與手術方式[J].中國普通外科雜志，2008，（11）：1051-1053.

[16] Shen YQ，Jia ZY，Nagele RG，et al.Srcuses Cas to suppress Fhl1 in order to promote nonanchored growth and migration of tumor cells[J].Cancer Res，2006，66（3）：1543-1552.

[17] Ding L，Niu C，Zheng Y，et al.FHLI interacts with estrogen receptors and regulates breast cancer cell growth[OL]. J Cell Mol Med，2009，Oct 16. [Epub ahead of print]

[18] Bonner AE，Lemon WJ，Devereux TR，et al.Molecular profiling of mouse lung tumors：Association with tumor progression，lung development，and human lung adenoeareinomas[J].Oncogene，2004，23（5）：1166-1176.

[19] 劉哲，許元鴻，龍錦，等.FHL1在人胰腺癌族中的表達及其與胰腺癌的侵襲及轉移的相關性研究[J].臨床與病理雜志，2015，35（3）：423-427.

[20] 吳成利，周洲，錢建新，等.FHL1在胃癌中的表達及其臨床意義[J].臨床病理學雜志，2011，16（3）：228-231.

（收稿日期：2017-09-12）endprint