堆肥方式和溫度對牛糞堆肥過程中天然類固醇激素降解的影響

王代懿，余 洋，張豐松，李性苑，茍體忠

(1.凱里學院 植物資源綜合利用研究所，貴州 凱里 556011； 2.中國地質環境監測院，北京 100081； 3.中國科學院 地理科學與資源研究所，北京100101)

堆肥方式和溫度對牛糞堆肥過程中天然類固醇激素降解的影響

王代懿1，余 洋2，張豐松3，*，李性苑1，茍體忠1

(1.凱里學院 植物資源綜合利用研究所，貴州 凱里 556011； 2.中國地質環境監測院，北京 100081； 3.中國科學院 地理科學與資源研究所，北京100101)

為了實現畜禽糞便的無害化處理及資源化利用，以新鮮牛糞和木屑作為堆料，采用微型試管堆肥法，模擬研究了好氧和厭氧2種堆肥方式下不同堆肥溫度(38、50、70 ℃)對黃體酮、雄烯二酮、17β-雌二醇、雌酮4種天然類固醇激素降解的影響。結果表明，不同溫度條件下4種激素在2種堆肥方式下的去除率介于67.6%～100%，其中50 ℃下的去除率為81.9%～100%。4種激素中，雌酮和雄烯二酮在好氧堆肥方式下的去除率優于厭氧堆肥。試驗溫度(38～70 ℃)對17β-雌二醇、黃體酮和雄烯二酮在牛糞堆肥中的降解影響很小，而在70 ℃的高溫堆肥條件下，雌酮的降解受到抑制。在保證堆肥腐熟、殺死有害微生物的前提下，50 ℃下好氧堆肥效果最佳。

天然類固醇激素；堆肥；降解

天然類固醇激素化合物是一類廣泛存在于環境中的內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，包括孕激素、雄激素、雌激素和腎上腺皮質激素，在動物和人體內合成，主要通過生物體以排泄的方式進入環境。天然類固醇激素化合物有著極強的內分泌干擾作用，在極低的環境濃度(0.1 ng·L-1)下就可能對生物體造成危害[1-2]。

天然類固醇激素主要通過動物糞便排放，經由養殖廢水[3]、環境污水[4]、糞便農用[5]等各種方式進入土壤及水體。在農業生產中，畜禽糞便一直被作為安全高效的有機肥廣泛應用。糞便農用可導致天然類固醇激素對土壤的污染，并流失進入地表水和地下水[6-7]。農民在蔬菜、瓜果與有機食品生產中盲目大量地施用有機肥，由此引發的農村面源污染問題已逐漸提上議事日程。一些學者指出，畜禽糞便農用已成為環境中天然類固醇激素的主要來源[8-10]。目前，國內外畜禽糞便的處置方式主要還停留在氮、磷、重金屬等常規污染防治和臭氣去除方面，重點發展趨勢主要集中在資源化，而對于排放的絕大多數天然類固醇激素類內分泌干擾物的防治還依然處于起步階段，有關畜禽糞便中天然類固醇激素去除方面的研究鮮見報道。對于畜禽糞便的源頭處理，目前比較適合我國國情的主流處理方法為堆肥法。為此，本文特選擇黃體酮(孕激素)、雄烯二酮(雄激素)、17β-雌二醇和雌酮(雌激素)4種典型天然類固醇激素為研究對象，探索不同堆肥溫度在好氧和厭氧條件下對堆肥過程中天然類固醇激素降解的影響，以期為我國農業生產中天然類固醇激素的污染風險防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 標準品及堆肥原料

黃體酮(PGT)、雄烯二酮(ADD)、17β-雌二醇(17β-E2)和雌酮(E1)均購于美國Sigma公司，純度為99.9%。堆肥原料是新鮮牛糞，采集于北京郊區某奶牛場。樣品先冷凍干燥，研磨后，過2 mm篩，待用。選用木屑作為牛糞堆肥的調理劑。牛糞的pH值為7.6，電導率(EC)為6.45 mS·cm-1，總氮(TN)含量1.98%，總碳(TC)含量30.27%，含水量45.1%；木屑的TN、TC含量分別為0.17%和45.98%，含水量5.6%。

1.2 堆肥參數及培養實驗

堆肥試驗采用微型試管堆肥法。堆肥原料(牛糞)和調理劑(木屑)按比例充分混合，獲得堆體初始碳氮比(C/N)為30。在堆體中加入去離子水，控制初始含水量為60%。同時，去離子水中分別添加天然類固醇激素標準品(PGT、ADD、17β-E2和E1)，使得堆體中各激素的初始濃度達到2 mg·kg-1(以干質量計)。準確稱取5 g堆肥樣品于50 mL試管中，分別模擬好氧和厭氧2種堆肥條件。好氧條件下的離心管使用紗布封口，期間每天稱重補水；厭氧條件下的離心管中充分通入氮氣，使用試管蓋密封。設置3組溫度(38、50、70 ℃)，將樣品分別置于相應條件下的氣候培養箱中培養7 d。培養后第7天取樣，測定各處理堆肥樣品中目標激素殘留量，每種處理均設置3個重復。

1.3 天然類固醇激素分析測定

精確稱取1.00 g堆肥樣品于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入40 μL中間混標儲備液作為內標(氘代物內標的標準品以甲醇為溶劑，分別配制成200 μg·mL-1的單標儲備液，再把各單標儲備液配制成各目標物濃度分別為1 μg·mL-1的中間混標儲備液)，再加入20 mL甲醇，渦旋振蕩后，超聲提取20 min。混合液在12 000 r·min-1高速離心5 min后，取出上清液，重新加入20 mL甲醇，重復2次。合并3次上清液，加入15 mL蒸餾水，再加入30 mL正己烷，棄去上層油脂層，重復1次。40 ℃下水浴旋蒸至約10 mL，加入100 mL蒸餾水稀釋。

取上步液體于250 mL錐形瓶中，加入10 mL二氯甲烷，充分振蕩，混合均勻，靜置分層后超聲，取下層溶液至250 mL茄形瓶中。重新加入10 mL二氯甲烷，重復2次，合并3次萃取液。40 ℃水浴下旋轉蒸發至近干，加入10 mL甲醇溶解，再加入100 mL蒸餾水稀釋。

選用HLB柱(規格為6 mL/500 mg)，6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈、12 mL水活化。將上步水溶液上樣，流速5 mL·min-1。10 mL水、5 mL 50%甲醇水溶液清洗，之后通過真空泵高負壓抽干30 min。15 mL乙酸乙酯和6 mL乙酸乙酯-乙腈(體積比1∶1)洗脫。將洗脫液收集至40 mL棕色螺旋口存儲瓶，氮吹至干，加入2 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)溶解。

選用NH2柱(規格為3 mL/500 mg)，4 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)、4 mL水飽和乙酸乙酯活化。將上一步溶解樣品上樣，自然流速，2 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)清洗。收集上樣溶液和清洗溶液至10 mL尖頭試管，氮吹至干。0.2 mL乙酸乙酯渦旋振蕩，超聲溶解10 s，加入1.8 mL正己烷，混合均勻。

選用Silica柱(規格為3 mL/500 mg)，4 mL水飽和乙酸乙酯、4 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)活化。將上一步溶解樣品上樣，自然流速。3 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)清洗，然后加入6 mL水飽和乙酸乙酯洗脫，洗脫液收集至10 mL尖頭試管，氮吹至干，再加入0.5 mL 40%乙腈-0.1%乙酸水溶液，超聲溶解10 s，轉移至2 mL進樣小瓶的內襯管中。

基于液相色譜串聯雙質譜聯用(LC-MS/MS)測定堆肥樣品中PGT、ADD、17β-E2和E1的濃度，具體地：0—2 min，用80%的0.1%乙酸(A)和20%的乙腈(B)洗脫，模式為CUR，正負離子分別為30、30；2—6 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脫，模式為Gas1，正負離子分別為80、80；6—15 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脫，模式為Gas2，正負離子分別為70、70；15—20 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脫，模式為IS，正負離子分別為5 500、-4 500；20—25 min，用20%的0.1%乙酸和80%的乙腈洗脫，模式為CAD，正負離子分別為3、3；25 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脫，模式為TEM，正負離子分別為550、550。

在堆肥原料中加入去離子水，控制初始含水量為60%，同時，水中添加天然類固醇激素標準品(PGT、ADD、17β-E2、E1)，使得堆體中各激素初始濃度達到50 ng·g-1(以干質量計)。隨后按上述分析測定方法進行回收試驗。結果表明，該方法堆肥樣品中目標激素的最低檢測限為0.32～16 ng·g-1，4種激素的回收率平均值分別為108.9%、100.9%、119.5%和95.5%，相對標準偏差分別為10.6%、9.4%、12.0%和8.5%，適合環境樣品分析。

2 結果與分析

2.1 堆肥方式的影響

本研究堆肥試驗分別在好氧和厭氧2種條件下進行，堆肥溫度50 ℃，4種天然類固醇激素在牛糞堆肥中的降解結果見圖1。相對于初始濃度2 mg·kg-1，4種天然類固醇激素在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率介于81.9%～100%。其中，17β-E2在2種方式下堆肥7 d后，殘留濃度均低于儀器檢測限，去除率達100%，PGT在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為99.89%和99.83%，并且PGT和17β-E2的去除基本不受氧氣條件的限制。E1和ADD在堆肥過程中的降解在一定程度上受氧氣條件的影響，E1在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為81.9%和98.0%，ADD在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為96.6%和100%，兩者在好氧堆肥下的去除效果均明顯優于厭氧堆肥。

有研究報道顯示[11]，在用牛糞、豬糞和雞糞改良的土壤中，E1在牛糞中的降解速率略高于在豬糞和雞糞中，17β-E2在上述3種糞便改良的土壤中降解速率變化不大。由此可以推理，若對其他類型糞便進行堆肥處理，天然類固醇激素也能達到類似的去除效果。從本試驗結果來看，堆肥過程中天然類固醇激素含量大幅降低，4種激素的去除率均達80%以上，尤其是17β-E2的去除率達100%。17β-E2被認為是普遍存在于各類環境介質中，且生物活性最強的一種雌激素[12]。由此可知，好氧堆肥是現階段去除糞便中天然類固醇激素最經濟有效的方法之一。

圖1 不同堆肥方式下牛糞中天然類固醇激素的殘留濃度Fig.1 Residue concentration of natural hormones in cow dung under different composting manners

2.2 堆肥溫度的影響

試驗結果(圖2)顯示，2種堆肥方式3種堆肥溫度下，4種目標激素在堆肥中的去除率介于67.6%～100%，其中，E1的去除率介于67.6%～98.0%，17β-E2在3種溫度下的去除率均為100%，PGT的去除率介于97.2%～99.9%，ADD的去除率介于96.9%～100%。4種激素中，E1在70 ℃高溫下降解率明顯降低，厭氧和好氧條件下去除率分別僅為73.3%和67.6%，其余3種激素的降解在試驗溫度范圍內(38～70 ℃)基本不受影響。

溫度是影響堆肥系統中微生物活動和工藝過程的重要因素，控制溫度的目的在于為微生物營造一個適合的溫度環境，以利于其繁殖和降解更多的底物。同時，堆肥溫度也是殺滅致病菌、去除水分的關鍵因素。按照美國環境保護署制定的相關標準[13]，堆體溫度在50 ℃以上保持5～7 d或55 ℃條件下保持3 d以上，是殺滅堆肥原料中所含致病微生物，保證堆肥的衛生指標合格和堆體腐熟的重要條件。堆肥中高于70 ℃以上的溫度比較罕見，并且對堆肥不利[14]。因此，本研究選擇38、50、70 ℃作為控制溫度，進行好氧和厭氧條件下的堆肥試驗。通常，嗜溫菌的最適溫度為30～40 ℃，嗜熱菌的最適溫度為50～60 ℃。在堆肥初期，堆體基本呈中溫，嗜溫菌得到大量繁殖，它們在利用有機物的過程中不斷釋放熱量，1～2 d即可以使堆體溫度達到50～60 ℃。在此溫度下，嗜溫菌大量死亡，嗜熱菌大量繁殖，同時堆體溫度明顯升高，堆肥發酵進入高溫，并在高溫范圍內穩定一段時間，使得堆肥中的寄生蟲和病原菌被殺死，腐殖質開始形成，堆肥達到初步腐熟[15]。

圖2 不同堆肥溫度下牛糞中E1、17β-E2、PGT和ADD的殘留濃度Fig.2 Residual concentration of E1， 17β-E2， PGT and ADD in cow dung under different composting temperature

本研究中，在好氧和厭氧條件下，38 ℃及50 ℃對天然類固醇激素的綜合去除效果都較好。綜合考慮對堆體中致病菌、蟲卵、寄生蟲、孢子以及雜草種子的殺滅，為保證堆肥的衛生指標和堆體腐熟，應選擇在50℃條件下進行好氧堆肥。

3 小結

本研究表明，當堆肥過度為38～70 ℃，在好氧或厭氧條件下，牛糞中E1、17β-E2、PGT和ADD的去除率介于67.6%～100%，50 ℃的去除率為81.9%～100%。4種激素中，雄烯二酮和雌酮在好氧堆肥方式下的去除率優于厭氧堆肥。試驗溫度(38～70 ℃)對17β-雌二醇、黃體酮和雄烯二酮在牛糞堆肥中的降解速率影響很小，而在70 ℃的高溫堆肥條件下，牛糞中雌酮的降解受到抑制。在去除天然類固醇激素的同時，綜合考慮堆肥的衛生指標和堆體腐熟，以50 ℃下進行好氧堆肥的整體效果最好。

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Effectsofcompostingtemperatureandmannerondegradationofnaturalhormonesduringcattlemanurecomposting

WANG Daiyi1， YU Yang2， ZHANG Fengsong3，*， LI Xingyuan1， GOU Tizhong1

(1.InstituteofComprehensiveUtilizationofPlantResources，KailiUniversity，Kaili556011，China; 2.ChinaInstituteofGeo-EnvironmentMonitoring，Beijing100081，China; 3.InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourceResearch，Beijing100101，China)

In order to achieve the innocuous treatment and resource utilization of livestock manure， fresh cow dung and straw were used as pile materials. Four types of hormone (progesterone ， androstenedione， 17β-estradiol and estrone) were incubated in cow dung under different temperature (38， 50， 70 ℃) to study the influence of composting temperature on the degradation rate of 4 hormones under either aerobic or anaerobic composting conditions. It was shown that the degradation rate of 4 hormones ranged from 67.6% to 100% under different temperature， and the degradation rate ranged from 81.9% to 100% at 50 ℃. The degradation rate of estrone and androstenedione were higher under aerobic composting than that under anaerobic composting. The tested temperature (38-70 ℃) had little effect on degradation of 17β-estradiol， progesterone and androstenedione in cow dung. But， the degradation of estrone was inhibited under 70 ℃. Giving compost maturity and removal of disease-causing organisms， aerobic composting under 50 ℃ seemed to be the best option.

natural hormones; composting; degradation

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2104-2108

http://www.zjnyxb.cn

王代懿，余洋，張豐松，等. 堆肥方式和溫度對牛糞堆肥過程中天然類固醇激素降解的影響[J]. 浙江農業學報，2017，29(12)： 2104-2108.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.20

2017-06-13

環保公益性行業科研專項(201509074)；凱里學院博士科研專項(BS201505)；貴州省科技廳聯合基金(黔科合LH字[2015]7752號);分析化學重點學科(院通字[2014]157號)

王代懿(1975—)，女，貴州景屏人，博士，研究方向為畜禽糞便資源化處理及其污染物環境行為。E-mail：wangdaiyi234567@163.com

*通信作者，張豐松，E-mail:zhangfs@igsnrr.ac.cn

X53

A

1004-1524(2017)12-2104-05

(責任編輯高 峻)