一株具有抑菌活性的酸棗內生菌的分離

鄧振山，魏婷婷，蘇 瑞，高 飛，劉玉珍，陳邦凱，莫達銳，何 茜，許紅霞

(延安大學 生命科學學院，陜西 延安 716000)

一株具有抑菌活性的酸棗內生菌的分離

鄧振山，魏婷婷，蘇 瑞，高 飛，劉玉珍，陳邦凱，莫達銳，何 茜，許紅霞

(延安大學 生命科學學院，陜西 延安 716000)

采用組織分離法和研磨涂布法篩菌以及對峙培養法進行抑菌試驗，C-22-1菌株的發酵液經過反復萃取分離得到有抗菌活性的物質，以抑菌圈大小為指標對C-22-1菌株發酵條件中的碳源、氮源和發酵時間進行單因素優化。C-22-1菌株發酵液及其活性物質對7種人體常見致病菌抑菌活性測定顯示，C-22-1菌株發酵液對白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)的抑菌圈直徑達29 mm，定性試驗顯示菌株C-22-1產皂苷類物質，單因素優化結果表明，菌株C-22-1的最佳碳源、氮源、時間分別是葡萄糖、酵母膏、8 d。初步確定C-22-1菌株可產抗菌活性物質為三萜皂苷。

陜北酸棗；內生菌；組織分離法；研磨涂布法；抑菌活性

植物體內普遍存在著內生菌，植物內生菌(endophyte)是指整個生活史或者是生活史中的某一階段能夠定殖在宿主植物健康細胞內或者細胞之間，卻不對其宿主產生病害癥狀的微生物[1-2]，可寄存在植物的根、莖、葉、花、果實及種子中。近年來，顏華等[3]、鄭艷等[4]、劉瑩等[5]、劉勝貴等[6]眾多學者從經濟林木、藥用植物、雜草等植物中分離到大量的內生菌，2010年黃海東等[7]從云霧龍膽中分離得到一株內生細菌，它的發酵液對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有抑菌效果。

酸棗[ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow.]為鼠李科，廣泛分布于我國中、北部地區，抗逆性強，是一種耐旱、耐寒、耐鹽堿的野生藥用植物。酸棗素有“天然維生素丸”之稱，此外酸棗還具有養心安神、補肝、斂汗的功效，主治心煩失眠、驚悸怔忡、體虛多汗、神經衰弱、多夢、汗少口干等癥狀。孫延芳等[8]發現酸棗中有酒石酸、檸檬酸、草酸等，有學者發現酸棗果肉中含有多種三萜類化合物[9-10]如蛇滕酸、麥珠子酸等。王向紅等[11]分析發現多種棗中的齊墩果酸和熊果酸的含量均顯著低于酸棗。

酸棗中有很多活性物質，1997年，首次從酸棗仁中分離得到黃酮類化合物[12]，曾路等[13]分離得到了斯皮諾素和酸棗黃素兩種黃酮類物質以及酸棗仁皂苷A、B(jujubosides A、B)。有研究表明，酸棗仁中的黃酮類化合物還有藥黃素[14]、當藥素(swertisin)、異斯皮諾素(isospinosin)、6″-對香豆酰斯皮諾素(6″-p-coumaroylspinsin)[15]、異牡荊素(isovitexin)[16]、槲皮素(quercetin)[17]。酸棗仁中含有的皂苷類物質有酸棗仁皂苷A1、B1、C[18]、D[19]，羽扇環烷型三萜類化合物有羅珠子酸甲酯。

目前對酸棗的研究也很多，但對酸棗內生菌的研究較少，目前僅劉東[20]、高振峰等[21]分別從山西酸棗體內分離獲得76株內生細菌和40株內生真菌，但有關陜北酸棗內生菌的研究鮮有報道。鑒于此，本研究從陜北酸棗葉片篩選內生菌，通過生物活性測定的方法選出有抑菌作用的菌株，并對其內生菌的次生代謝產物進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料的采集

酸棗[ZizyphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu]植株于2015年5月采自延安大學后山、延安鳳凰山(不帶根)，采樣后立即帶回實驗室供當天試驗使用，剩余的葉片置于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 指示菌株

指示菌株均來于延安大學醫學院，由延安大學生命科學學院微生物實驗室保藏，指示菌編號見表1。

1.1.3 培養基

篩選培養基：(1)PDA培養基；(2)牛肉膏培養基；(3)高氏培養基；(4)改良培養基1：葉片煮沸濾液1 000 g、NaCl 5 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g、pH 自然；(5)改良培養基2∶NaCl 1 g、CaCl20.5 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.02 g、(NH4)2SO41 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2；

發酵培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g 、NaCl 5 g、MgSO45 g、K2HPO41 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

優化培養基：(1)碳源篩選用基礎培養基(g·L-1)：各種碳源3 g、蛋白胨10 g、K2HPO43 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH自然。(2)氮源篩選用基礎培養基(g·L-1)：葡萄糖3 g、各種氮源10 g、K2HPO43 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH自然。

1.2 方法

表1指示菌株編號

Table1Indicator strain number

菌株編號No．ofstrains指示菌株IndicatorstrainP?1大腸埃希菌(Escherichiacoli)P?2傷寒桿菌(Salmonellatyphi)P?3檸檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)P?4福氏痢疾桿菌(Shigellaflexneri)P?5白色念球菌(Moniliaalbican)P?6金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)P?7白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)

1.2.1 酸棗葉片內生菌的篩選

1.2.2 內生菌抑菌活性測定

挑取備用斜面上的菌種復壯，無菌條件下取直徑為10 mm的復壯菌株的菌餅3～5個，接種于已滅菌的PDA液體培養基中，置于32 ℃恒溫振蕩培養器中以160 r·min-1培養18～24 h。無菌條件下，用無菌棉簽將致病菌株涂滿牛肉膏固體培養基，接著用直徑10 mm的無菌打孔器在涂滿致病菌的培養基上打孔并注入內生菌發酵液，對照組在孔中注入無菌水，試驗組設置3個重復，置于32 ℃恒溫培養箱培養2～4 d后觀察并測量抑菌圈直徑。發酵產物抑菌活性測定參考文獻[22]。

1.2.3 菌種鑒定

生理生化鑒定：篩選的內生菌菌株進行革蘭氏染色、甲基紅測定、V-P 測定、淀粉水解、吲哚產生和檸檬酸利用檢測試驗，試驗測定方法及初步鑒定方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》[23]。

16S rRNA鑒定：采用菌落PCR[24]方法擴增菌株C-22-1的16S rDNA，采用基因保守序列通用引物，P1(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)和P6(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)進行 PCR擴增，50 μL 反應體系：2×EsTaqMasterase 25 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水補足至反應總體積50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存。獲得的 16S r RNA 基因序列提交到NCBI的GenBank基因庫，進行BLAST比對，與數據庫中的已知序列進行同源性分析，運用MEGA 6.06軟件生成NJ進化樹。

1.2.4 代謝產物的分離提取

將菌株C-22-1擴大培養，無菌條件下，取直徑1 mm的內生菌菌餅4～5個，接種于含200 mL的發酵液培養基中，接種25瓶，置于32 °C、160 r·min-1搖床中振蕩培養7 d。將發酵液離心去菌體，收集并濃縮菌液，將5 L的發酵液濃縮至300 mL。濃縮后的發酵液與70%乙醇按體積比1∶9混合后浸泡2 h，40 °C超聲處理10 min，收集液體，濃縮，用正丁醇進行萃取，濃縮，再用正丁醇反復萃取2次，收集液體并用砂芯過濾裝置過濾，最后進行濃縮并收集。

1.2.5 C-22-1發酵產物的定性試驗

在研究C-22-1菌株所產皂苷的生物活性之前，首先通過皂苷的通性進行定性試驗，確定C-22-1菌株發酵產物的總皂苷中含有皂苷類物質，從而對其進行下一步研究。泡沫試驗、濃硫酸-乙酸反應、氯仿-濃硫酸反應、香草醛-高氯酸反應參考邵青[25]的方法進行定性試驗。

HPLC檢測：甲醇分別溶解標準品、樣品于容量瓶中備用。

皂苷檢測：色譜柱為Kromasil C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(0.2%磷酸)=50∶50；流速0.8 mL·min-1；檢測波長210 nm；柱溫25 °C；進樣量10 μL。

1.2.6 菌株發酵條件優化

單因素試驗：菌株C-22-1分別接種于以葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源的液體培養基和以蛋白胨、酵母膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨為氮源的液體培養基中，在32 °C，恒溫振蕩培養器中以160 r·min-1的轉速培養4 d后取出備用。以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.2.2節的方法進行抑菌活性測定，設置3重復。選出最佳碳源、氮源的培養基為發酵培養基，發酵時間按5、6、7、8、9 d，參照1.2.2節進行試驗。

響應面試驗設計：為了優化發酵條件，在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert試驗設計軟件對菌株C-22-1的發酵條件進行優化，以對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小為響應值(Y)，對碳、氮源和發酵時間3個因素設計3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗因素與水平(表2)。

表2響應面設計表

Table2Response surface design

水平LevelA，葡萄糖A，GlucoseB，酵母膏B，YeastextractC，時間C，Fermentationtime/d-13875051080151285

2 結果與分析

2.1 酸棗內生菌的篩選

采用組織分離法和研磨涂布法從酸棗葉片組織中共分離得到23株內生菌，編號為C-01-1至C-23-1，C-22-1的發酵液的抑菌效果好，對7種人體常見致病菌均有抑制作用，除對白色念球菌(Moniliaalbican)的抑菌圈直徑為12 mm外，對其他病原菌的抑菌圈直徑均大于16 mm，抑菌活性強，所以選擇其作進一步研究。

2.2 酸棗內生菌發酵液抑菌活性測定及產物抑菌活性測定

對所分離的內生菌的抑菌活性進行初步篩選，其中菌株C-22-1對7種人體常見致病菌的抑制效果均較好(表3)，因此選擇其進行后續試驗。同時發酵產物對人體常見致病菌的抑菌活性測定結果(圖1)顯示，4號致病菌(福氏痢疾桿菌Shigellaflexneri)的最低抑制濃度最小，對其抑制效果最好。

2.3 菌株鑒定

菌株C-22-1的菌落特征是表面粗糙，扁平，菌落不規則，菌株C-22-1的細胞呈直桿狀，菌落圓形，乳白色，邊緣整齊，光滑；菌株C-22-1的V.P、檸檬酸鹽反應均為陰性，產生吲哚、能水解淀粉，甲基紅試驗顯陽性。菌株C-22-1的16S rDNA序列(GenBank登錄號KY393358)與NCBI數據庫進行比對分析，與其同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，通過構建的系統發育樹聚類分析可以看出，菌株C-22-1與BacillusgaemokensisKCTC 13318 (登錄號LTAQ01000012)屬于同一分支即它們有可能為同一類群(圖2)。綜合形態、結構、生理生化特征和同源性分析，菌株C-22-1為蠟狀芽孢桿菌。

表3C-22-1對7種致病菌的抑制直徑

Table3Inhibitory effect of C-22-1 on 7 kinds of pathogenic bacteria in diameter

病原菌株Pathogen抑菌圈直徑/mmAntibioticcirclediameter/mmP?12433±1155abABP?22133±1527bBCP?32300±2bABP?42433±4932abABP?51367±2，887cCP?62400±4582abABP?72933±3055aA

同列數據后標有不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，標有不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。

Different from the column data is marked with a lowercase letter， the difference was significant (P<0.05), marked with a different capital letters， the differences were extremely significant (P<0.01).

1，大腸埃希菌(Escherichia coli)；2，傷寒桿菌 (Salmonella typhi)；3，檸檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus)；4，福氏痢疾桿菌 (Shigella flexneri)；5，白色念球菌(Monilia albican)圖1 C-22-1產物對5種致病菌的抑制直徑Fig.1 Inhibitory effect of C-22-1 on 5 kinds of pathogenic bacteria in diameter

圖2 菌株C-22-1的16S rDNA基因系統發育樹Fig.2 Phylogenntic tree of strain C-22-1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 C-22-1發酵產物的定性試驗結果

(1)泡沫試驗：樣品產生了肥皂樣泡沫，且15 min后泡沫仍未消失，空白對照處理雖然也出現泡沫，但量極少且在30 s內消失，此結果也可以初步說明C-22-1粗皂苷樣品中可能含有皂苷。

(2)濃硫酸-乙酸反應：試管內顯示紅色，并未出現污綠色，說明樣品中含有三萜皂苷。

(3)氯仿-濃硫酸反應：試驗結果顯示溶液出現分層，在氯仿層顏色為淺紅色，硫酸層出現綠色的熒光。空白對照試驗則無此色澤變化。

(4)香草醛-高氯酸反應：試管溶液最終顯示紅色。香草醛-高氯酸反應是皂苷類物質的顯色方法，高氯酸的酸性極強，可與皂苷發生氧化反應使其脫氫，再與香草醛作用繼而形成特征性的紅色。

(5)HPLC檢測：由圖3-a-可以發現，標準品的出峰時間大約在3.762 min，受樣品中雜質等干擾的影響，兩個圖譜存在一定的差別，但兩圖譜就總體對比而言，C-22-1正丁醇部位的樣品的出峰時間和柴胡皂苷A標準品的出峰時間大致相同(圖3-b)，因此可以初步判定C-22-1正丁醇部位提取的樣品中含有皂苷類物質。

2.5 發酵培養條件優化

由圖4-a可知，菌株C-22-1以葡萄糖為碳源時抑菌圈最大，故最優碳源選為葡萄糖；由圖4-b可以看出，菌株C-22-1以酵母膏為氮源時抑菌圈最大，因此最佳氮源為酵母膏；由圖4-c可知，菌株C-22-1在發酵前8 d抑菌圈也呈上升趨勢，第9天開始下降，因此最佳發酵時間為8 d。

回歸模型P<0.01表明，回歸模型極顯著；失擬項P=0.392，不顯著，說明該模型成立，回歸模型中一次項A、二次項A2、B2、C2以及AC的交互作用對金黃色葡萄球菌的抑菌圈的影響極顯著(P<0.01)。

a， 柴胡皂苷A標準品的HPLC色譜圖；b， C-22-1正丁醇部位提取的樣品的HPLC色譜圖a， Saiko saponin A standard HPLC chromatogram；b， C-22-1 N-butanol extraction HPLC chromatogram of the sample圖3 HPLC色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography (HPLC) figure

圖4 不同碳源、氮源、時間對菌株C-22-1抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different carbon source， nitrogen source and time on antibacterial activity of strain C-22-1

響應曲面能直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，交互作用不顯著時，表現為曲線較為平滑，近似圓形，交互作用極顯著時表現為曲線較陡，接近橢圓形。由圖5可以看出，A和B、C和D的交互作用不顯著，A和C的交互作用顯著，與表4結果基本一致。

利用Design-Expert 8.06軟件得出菌株C-22-1的最佳發酵條件為葡萄糖4.28 g·L-1，酵母膏10.12 g·L-1，發酵時間8.01 d，考慮到實際操作，將最佳發酵條件設定為葡萄糖4.30 g·L-1，酵母膏10 g·L-1，發酵時間8 d。

3 討論

從菌株C-22-1發酵液及活性物質抑菌試驗結果顯示其對人體一些常見致病菌的抑制效果很明顯，可以為藥物制備提供種質資源。有研究者從酸棗植株中分離提取出黃酮類、皂苷類化合物[26]，菌株C-22-1可以產生皂苷類化合物，這可能與內生菌與宿主植物長期共生的協同演化有關。盡管初步鑒定了兩株菌代謝產物均含有黃酮、皂苷類化合物，但還需要進一步對其代謝產物分離純化。從HPLC圖中可看出樣品中雜質較多，純度低，需要借助紫外光譜、質譜、紅外光譜、核磁共振等技術手段進行結構分析。

植物內生菌可在離體培養的條件下，采用發酵獲得大量活性物質[27]，從而解決某些藥用植物資源緊缺、生長緩慢和生態破壞等問題。本試驗發現，酸棗內生菌可合成多種活性物質，具有廣譜的抗菌作用。本試驗采用組織分離法和研磨涂布法從陜北酸棗葉片中篩選內生菌共23株，包括20株內生細菌，內生細菌占總數的86.96%，初步證實酸棗葉片中內生菌種類豐富。經測定得到10株有抑菌活性的菌株，占分離總數的43.48%。其中菌株C-22-1對七種病原菌以及與幾種常用抗生素相比，C-22-1發酵液均具有較強的抑菌效果，所以選其進行更多的研究。本試驗還對菌株C-22-1發酵的主要影響因素碳源、氮源以及發酵時間進行單因素優化分析，明確碳源、氮源和時間對菌株抑菌活性的影響，以及得出最佳發酵條件。

表4回歸模型方差分析

Table4Regression model variance analysis

變異源Source平方和SS自由度df均方MSF值FvalueP值Pvalue顯著性Significance模型Model151099117691678879085168007914100006SignificantA?葡萄糖231125123112524909545800016??B?酵母膏0101251010125109122401803309C?時間040510405436489607400751AB00025100025002694380308743AC0811081872979214800013??BC0091009096997690503575A＾21413918421114139184211523853572<00001??B＾2692551692557463972286<00001??C＾2210760526312107605263227147603400020??殘差Residual0649570092785714失擬項Lackoffit025753008583333308758503405244notsignificant純誤差Pureerror039240098總誤差Cortotal298211764716

表5方差分析其他參考項

Table5Other variance analysis references

參考項Referenceitems數值Value參考項Referenceitems數值Value標準偏差Std．Dev．0304607476R?Squared0978220175Mean2954117647AdjR?Squared0950217543C．V．%1031128452PredR?Squared0841304048PRESS47325AdeqPrecision162226991

圖5 葡萄糖、酵母膏和發酵時間對金黃色葡萄球菌的抑菌圈的響應曲面Fig.5 Response surface of glucose， yeast extract and fermentation time

從酸棗葉片中篩選出的菌株C-22-1的生理生化反應以及16S rRNA的結果與Jung等[28]從潮灘沉積物中篩出來的菌株BL3-6的結果一致，結果顯示，該菌株為蠟狀芽孢桿菌，可以降解石油。

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Isolationofanendophyticbacterialstrainwithantifungalactivityfromwildjujube

DENG Zhenshan， WEI Tingting， SU Rui， GAO Fei， LIU Yuzhen， CHEN Bangkai， MO Darui， HE Xi， XU Hongxia

(CollegeofLifeScience，Yan’anUniversity，Yan’an716000，China)

Using tissue separation and grinding coated method， the endophytes were screened out to study the active substances in the leaves of wildjujubeendophytic microbes and species identification， and the filter method was used to test the antibacterial activities. The fermented product extraction of strain C-22-1 was extracted again and again to gain the antimicrobial substances. The single fermentation conditions of strain C-22-1， including carbon source， nitrogen source and time， were optimized according to the size of inhibition zone. The antibacterial activities of fermented liquid of C-22-1 and the antimicrobial substances were detected to seven human common pathogenic bacteria; the strain C-22-1’s antibacterial circle diameter reached 29 mm toStaphylococcusalbus. Qualitative test showed the strain C-22-1 produce saponins. Single factor optimization results showed that best carbon， nitrogen source and time was glucose， yeast extract and 8 d， respectively. Strain C-22-1 produce antimicrobial substances， which was initially identified as triterpenoid saponins.

wildZizyphusjujube; endophytes; tissue separation method；grinding coated method; antimicrobial activity

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2068-2076

http://www.zjnyxb.cn

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.15

2017-06-14

陜西省科技統籌創新工程(2012KTZB03-02-03，2012CGX7，2016TTC-N-3-1) ; 延安市科技局重大專項(2014CGZH-06)；陜西省教育廳服務服務地方專項計劃項(16JF029)；延安市菌草工程研究中心專項基金；延安市生物資源開發與利用科技創新團隊專項基金；延安大學“陜北微生物資源與利用研究中心” 科研機構專項基金；延安大學產學研合作研發項目

鄧振山(1969—)，男，陜西黃陵人，博士，副教授，主要從事微生物資源與利用和環境微生物學研究。E-mail: zhenshandeng214@163.com

S476.1

A

1004-1524(2017)12-2068-09

(責任編輯張 韻)