鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細胞抗原表位的鑒定

張 琳，余 斌，倪 征，陳 柳，云 濤，葉偉成，華炯鋼，崔言順，張 存

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 210021； 2.山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細胞抗原表位的鑒定

張 琳1，2，余 斌1，*，倪 征1，陳 柳1，云 濤1，葉偉成1，華炯鋼1，崔言順2，張 存1

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 210021； 2.山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

為鑒定鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)的B細胞抗原表位，以純化的DTMUV YY5株為抗原制備了2株單克隆抗體AE4和BD10，研究證實BD10為線性化表位，其結合的抗原表位位于E蛋白的第三結構域(Domain Ⅲ，DⅢ)。將DTMUV E蛋白DⅢ結構域基因截短為具有末端相互重疊的15段，與MBP融合表達后以單克隆抗體BD10進行肽庫掃描，結果篩選出DTMUV一個B細胞線性表位385LVGSGKGQI393(EP385)。該表位原核融合表達產物免疫小鼠制備的抗體，能夠和DTMUV E蛋白反應，表明EP385表位具有良好的免疫原性，可為DTMUV多肽疫苗的研制及特異血清學診斷方法的開發奠定基礎。

鴨坦布蘇病毒；單克隆抗體；肽庫掃描；抗原表位

2010年4月以來，浙江、江蘇、安徽、福建、上海、山東、河北等水禽主產區先后暴發一種以蛋鴨、種鴨產蛋量驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病，經濟損失高達數十億元[1]。隨著病原學研究的深入，該病病原被確定為一種黃病毒，即鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)[2]。近年來，鴨坦布蘇病毒病的流行呈現地方流行性，是危害我國水禽養殖業的主要疫病。

DTMUV基因組由5’端和3’端非編碼區和一個開放閱讀框組成，編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白，其中DTMUV E蛋白由501個氨基酸殘基構成，含有1個糖基化位點[3-4]。根據黃病毒科病毒的結構特點，推測DTMUV E蛋白位于病毒表面，參與受體結合、膜融合和侵入等環節，在病毒感染靶細胞過程中起著關鍵作用[4-5]。黃病毒E蛋白在空間上形成3個不同的結構域，即DⅠ，DⅡ，DⅢ結構域[5]。DⅢ結構域是一個假定的受體結構域，是病毒與細胞受體結合的區域，其內可能含有與病毒致病性相關的抗原決定簇[6-11]。本研究針對E蛋白DⅢ結構域，融合表達15個末端相互重疊的短肽，這些短肽覆蓋E蛋白DⅢ結構域的291～406位氨基酸，利用肽庫掃描精確定位E蛋白DⅢ結構域的一個B細胞線性表位，為研究基于抗原表位的新型疫苗和診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

DTMUV YY5分離株、小鼠骨髓瘤細胞株(SP2/0)、融合表達載體pMBP-C為本實驗室保存；BALB/c小鼠購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；膠回收試劑盒、pMD18-T載體、限制性內切酶、DNA Marker購自寶生物公司；Trans10、Trans-T1感受態購自北京全式金公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；弗氏佐劑、PEG3350、HAT、HT購自SIGMA公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體制備

將DTMUV YY5株在DF-1細胞增殖后，采用不連續蔗糖梯度離心法[3]提純病毒。純化病毒用β-丙內酯滅活，進行BALB/c小鼠的免疫以及細胞融合[9]，用間接免疫熒光(IFA)和間接ELISA[12]交叉篩選雙陽性雜交瘤細胞株。

1.2.2 融合蛋白的表達及純化

根據E蛋白基因序列，遞交生物信息學網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/software.php)進行B細胞表位預測，設計一套覆蓋E蛋白DⅢ結構域(AA291-AA406)并盡可能涵蓋預測表位的15個短肽，這些短肽長約16個氨基酸，相鄰兩個短肽末端彼此重疊6～8個氨基酸。針對每條短肽合成正負2條寡核苷酸鏈(表1)，相互配對，每對寡核苷酸鏈退火后在5’端和3’端分別形成BamHI和NheI粘性末端。將退火的DNA與經BamHI、NheI雙酶切的pMBP-C載體連接，轉化Trans10感受態細胞，將測序正確的陽性克隆擴大培養，培養至對數生長期(D600=0.6)時加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，30 ℃誘導培養3 h；收集表達菌體，經超聲裂解后，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液以直鏈淀粉樹脂柱親和層析法純化融合蛋白。10% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達和純化情況。

1.2.3 抗原表位篩選

E蛋白抗原表位篩選采用間接ELISA法測定[12]。包被抗原為純化的E蛋白DⅢ結構域及其15個短肽融合蛋白，包被濃度為5 μg·mL-1；封閉液為含5%脫脂乳的PBST(PBS，pH 7.4，含0.1% Tween-20)，37 ℃封閉2 h。一抗為單抗雜交瘤細胞培養上清液，37 ℃孵育1 h；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h。顯色液為TMB，避光顯色10 min后加入H2SO4終止液終止反應，450 nm波長測量吸收值。

1.2.4 抗原表位鑒定

以免疫印跡試驗(Western blot)鑒定E蛋白抗原表位。將純化的重組蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉印至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂乳封閉，4 ℃冰箱中過夜；用PBST洗3次，置于1∶10稀釋的雜交瘤細胞培養上清中，室溫孵育1 h；洗滌3次后置于1∶5 000稀釋的酶標羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗滌3次后，以DAB顯色。

1.2.5 抗原表位的抗原性驗證

在E蛋白DⅢ結構域的15段短肽中，單克隆抗體BD10與E12和E13的2個相鄰重組蛋白呈現明顯的陽性反應，而其他短肽則呈陰性。為此，針對E12，E13重疊部分(385LVGSGKGQI393)，按大腸桿菌密碼子優化合成2條寡核苷酸鏈(F∶5’-gatccAtcttagtaggaagtggaaaaggacagg-3’，R∶5’-ctagcctgtccttttccacttcctactaagaTg-3’)，進行表位多肽的表達和純化。以重組蛋白免疫試驗兔制備高免血清，Western Blot檢驗其與E蛋白及其表位的免疫反應。

表1編碼短肽寡核苷酸序列表

Table1Synthesized DNA sequences which encoding the short peptides

引物Primer引物序列(5’～3’)PrimersequenceE1F：gatccATGCAGGGTTTGAAGCTGAAAGGAATGACCTACCCGATGTGTAGCAATgR：ctagcATTGCTACACATCGGGTAGGTCATTCCTTTCAGCTTCAAACCCTGCATgE2F：gatccATGACCTACCCGATGTGTAGCAATACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTgR：ctagcAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTATTGCTACACATCGGGTAGGTCATgE3F：gatccACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTACCGACACTGGGCATGGCACTGTCgR：ctagcGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTgE4F：gatccACCGACACTGGGCATGGCACTGTCGTGGTGGAATTGTCTTATGCAgR：ctagcTGCATAAGACAATTCCACCACGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTgE5F：gatccGTGGAATTGTCTTATGCAGGTACCGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCgR：ctagcGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCGGTACCTGCATAAGACAATTCCACgE6F：gatccGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCATGTCGGCAGATCTGAATgR：ctagcATTCAGATCTGCCGACATGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCgE7F：gatccATGTCGGCAGATCTGAATGACATGACACCAGTTGGACGCTTGATAgR：ctagcTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATGTCATTCAGATCTGCCGACATgE8F：gatccATGACACCAGTTGGACGCTTGATAACAGTCAACCCATACGTGTCGgR：ctagcCGACACGTATGGGTTGACTGTTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATgE9F：gatccATAACAGTCAACCCATACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAgR：ctagcTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTATGGGTTGACTGTTATgE10F：gatccTACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAATGGTGGAAGTGgR：ctagcCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTAgE11F：gatccGCCAAGATAATGGTGGAAGTGGAACCTCCATTCGGGGATTCAgR：ctagcTGAATCCCCGAATGGAGGTTCCACTTCCACCATTATCTTGGCgE12F：gatccCCTCCATTCGGGGATTCATTCATCTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGAgR：ctagcTCCTTTTCCACTTCCTACTAAGATGAATGAATCCCCGAATGGAGGgE13F：gatccTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGACAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAgR：ctagcTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGTCCTTTTCCACTTCCTACTAAgE14F：gatccCAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGgE15F：gatccCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGg

2 結果

2.1 單克隆抗體制備

以純化的DTMUV為抗原，按常規方法進行小鼠免疫和細胞融合，用間接免疫熒光(IFA)和DⅢ-ELISA交叉篩選到2株雙陽性單克隆抗體，分別命名為AE4和BD10(圖1)。免疫印跡結果顯示，BD10能夠特異性地識別DTMUV E蛋白，而AE4則不能(圖2)。由此推定BD10識別病毒E蛋白DⅢ結構域的線性表位，而AE4可能識別的是構象表位。

A，AE4；B，BD10；C，陽性對照；D，陰性對照A， AE4； B， BD10； C， positive control； D， negative control圖1 單克隆抗體的間接免疫熒光反應Fig.1 IFA results of McAbs against DTMUV

2.2 融合蛋白的表達與純化

將編碼DTMUV E蛋白的15個短肽和表位短肽的核苷酸序列，插入大腸桿菌表達載體pMBP-C，重組菌經IPTG誘導后，SDS-PAGE顯示在細胞裂解上清中可見到與目的蛋白大小一致的條帶。將上述可溶性表達產物過Amylose親和層析柱純化后，獲得了純化的融合蛋白(圖3)。

2.3 抗原表位的篩選

15段短肽鏈經可溶性表達、純化后，用ELISA 和Western blot法進行肽庫掃描。結果顯示短肽E12和E13能夠與BD10呈陽性反應(圖4，圖5)。E12和E13兩個融合短肽中，重疊的序列為LVGSGKGQ(圖6)。為進一步驗證該氨基

酸序列，重新設計并合成了表達該短肽的核苷酸序列，經原核表達和Western blot鑒定，結果顯示385LVGSGKGQ393為單抗BD10所識別線性表位的核心序列，將該表位命名為EP385。

2.4 抗原表位的抗原性驗證

A，BD10；B，AE4。M，marker; 1，MBP；2，MBP-E 重組蛋白A， BD10；B， AE4. M， marker; 1， MBP；2， MBP-E recombinant protein 圖2 單克隆抗體的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of MAb BD10 and AE4

融合表達的表位短肽純化后免疫小鼠，制備免疫血清，通過免疫印跡反應分析，結果表明融合的表位短肽能夠誘導小鼠產生針對表位的特異性抗體，驗證385LVGSGKGQ393確實是B細胞的1個線性表位，且具有良好的免疫原性和反應原性(圖7)。

M，marker；1，MBP空載體；E1～E15，MBP-短肽融合蛋白；94102，MBP-EP385M， marker； 1， MBP； E1-E15， MBP-Peptide fusion protein； 94102， MBP-EP385圖3 短肽和表位融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion proteins

圖4 表位的ELISA篩選Fig.4 Mapping of epitopes by ELISA with BD10

3 討論

研究抗原表位有助于了解抗原結構及抗原變異預測，為表位疫苗以及分子診斷技術研究奠定基礎。常用的鑒別B細胞抗原表位的方法主要有：肽探針掃描技術、噬菌體展示技術和計算機軟件預測等[14]。軟件預測雖然簡單快速，但準確性欠佳，預測結果只能作為確定各個蛋白潛在表位的參考，最終還需進一步的實驗結果來確認[15]。本文以制備的單克隆抗體為研究工具，采用間接ELISA及Western blot法進行肽庫掃描，結合計算機模擬分析對抗原表位進行研究，取得了較為理想的結果。

圖5 表位的western blot 篩選Fig.5 Mapping of epitopes by western blot with BD10

圖6 E蛋白表位鑒定結果示意圖Fig.6 Schematic diagram of E protein epitope identification

M， marker；1，DⅢ重組蛋白；2，MBP-EP385；3，MBP-E融合蛋白M， marker； 1， DⅢ recombinant protein； 2， MBP-EP385； 3， MBP-E recombinant protein圖7 Western blot鑒定抗原表位EP385Fig.7 Western blot confirmation of the epitope EP385

在單克隆抗體制備過程中，采用間接免疫熒光(IFA)和間接ELISA交叉篩選，獲得AE4和BD10 2株雙陽性單克隆抗體。Western blot鑒定結果顯示，BD10能夠特異性的識別DTMUV E蛋白，而AE4則不能，由于SDS-PAGE凝膠電泳和轉印過程中蛋白變性，由此推測單抗BD10識別DTMUV E蛋白的線性表位，而單抗AE4識別E蛋白的構象表位。為了更詳細地研究BD10的特異性以及對其表位進行作圖，將DTMUV YY5株E蛋白DⅢ區截短為具有部分序列重疊的15段短肽，以大腸桿菌表達系統原核表達為融合MBP標簽的重組蛋白，用肽探針掃描技術鑒定BD10識別的核心區域為385LVGSGKGQI393，序列對比表明該表位序列與GenBank已公布鴨、鵝坦布蘇E蛋白相應序列均保守。

鴨坦布蘇病毒病作為一種新發傳染病，近年來已經傳播至全國各水禽主產區，嚴重影響鴨鵝產業的健康發展[16-18]。本研究鑒定出坦布蘇病毒E蛋白B細胞線性表位，對于研究鴨坦布蘇病毒的表位疫苗和建立診斷方法具有重要意義。

[1] 曹貞貞， 張存， 黃瑜，等. 鴨出血性卵巢炎的初步研究[J]. 中國獸醫雜志， 2010， 46(12):3-6.

CAO Z Z， ZHANG C， HUANG Y， et al. Preliminary studies on duck hemorrhagic ovaritis[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine， 2010， 46(12):3-6. (in Chinese with English abstract)

[2] CAO Z Z， ZHANG C， LIU Y H， et al. Tembusu virus in ducks， China[J].EmergingInfectiousDiseases， 2011， 17(10):1873-1875.

[3] YUN T， NI Z， HUA J， et al. Development of a one-step real-time RT-PCR assay using a minor-groove-binding probe for the detection of duck Tembusu virus[J].JournalofVirologicalMethods， 2012， 181(2):148-154.

[4] YUN T， ZHANG D， MA X， et al. Complete genome sequence of a novel flavivirus， duck tembusu virus， isolated from ducks and geese in China[J].JournalofVirology， 2012， 86(6):3406-3407.

[5] MUKHOPADHYAY S， KUHN R J， ROSSMANN M G. A structural perspective of the flavivirus life cycle[J].NatureReviewsMicrobiology， 2005， 3(1):13-22.

[6] 鄧永強，秦鄂德.蟲媒黃病毒包膜E蛋白的研究進展[J].軍事醫學科學院院刊， 2006，30(6):575-579.

DENG Y Q， QIN E D. Advances in researches on the envelope protein of arthropod-borne flaviviruses[J].MilitaryMedicalSciences， 2006，30(6):575-579.(in Chinese with English abstract)

[7] TEIXEIRA L， MARQUES R M，GUAS A P， et al. A simple and rapid method for isolation of caliciviruses from liver of infected rabbits[J].ResearchinVeterinaryScience， 2011， 91(1):164-166.

[8] CECILIA D， GOULD E A. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants[J].Virology1991， 181(1): 70-77.

[9] RYMAN， K D， LEDGER T N， CAMPBELL G A， et al. Mutation in a 17D-204 vaccine substrain-specific envelope protein epitope alters the pathogenesis of yellow fever virus in mice[J].Virology， 1998， 244(1):59-65.

[10] SERAFIN I L， AASKOV J G. Identification of epitopes on the envelope (E) protein of dengue 2 and dengue 3 viruses using monoclonal antibodies[J].ArchivesofVirology， 2001， 146(12):2469.

[11] THULLIER P， DEMANGEL C， BEDOUELLE H， et al. Mapping of a dengue virus neutralizing epitope critical for the infectivity of all serotypes: insight into the neutralization mechanism[J].JournalofGeneralVirology， 2001， 82(8): 1885-1892.

[12] 余斌，華炯鋼，劉躍生，等. 鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立和應用[J].浙江畜牧獸醫，2014，39(5):1-6.

YU B， HUA J G， LIU Y S， et al. Establishment of an indirect ELISA for detection of antibody against duck Tembusu virus[J].ZhejiangJournalAnimalScienceandVeterinaryMedicine， 2014，39(5):1-6. (in Chinese)

[13] 張琳. 鴨坦布蘇病毒E蛋白抗原表位的鑒定[D]. 泰安：山東農業大學，2013.

ZHANG L. Antigenic epitopes identification of duck Tembusu virus envelope protein[D]. Tanan: shandong Agricultural University, 2013.(in Chinese with English abstract)

[14] 王芳，劉曉麗，趙飛，等. 禽傳染性支氣管炎病毒單克隆抗體的制備及其B細胞抗原表位的鑒定[J]. 中國預防獸醫學報， 2012， 34(4):309-312.

WANG F， LIU X L， ZHAO F， et al. Epitope identification of N protein in avain infectious bronchitisvirus ck/CH/LDL/091022 strain[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine， 2012， 34(4):309-312. (in Chinese with English abstract)

[15] 李慧瑾， 郭春艷， 趙彭花，等. 運用單克隆抗體分析流感病毒H1亞型HA蛋白的抗原表位[J]. 西安交通大學學報(醫學版)， 2012， 33(3):291-294.

LI H J， GUO C Y， ZHAO P H， et al. Analysis of epitopes of HA of H1 subtype influenza virus using monoclonal antibodies[J].JournalofXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences)， 2012， 33(3):291-294. (in Chinese with English abstract)

[16] 李劍秋， 周彩琴， 余斌，等. 浙江省鴨、雞、鵝群感染坦布蘇病毒的血清學調查與分析[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(4):563-566.

LI J Q， ZHOU C Q， YU B， et al. Seroepidemiological investigation and analysis on duck Tembusu virus antibody level in Zhe-jiang Province[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016， 28(4):563-566. (in Chinese with English abstract)

[17] 馬建云， 張存， 武瑋. 一例種鵝坦布蘇病毒病的診治[J]. 中國家禽， 2013， 35(14):58-59.

MA J Y， ZHANG C， YU W. Diagnosis and treatment on a goose infected duck Tembusu virus[J].ChinaPoultry， 2013， 35(14):58-59. (in Chinese)

[18] 趙冬敏， 黃欣梅， 劉宇卓，等. 新型黃病毒在種鵝中垂直傳播的研究[J]. 南方農業學報， 2012， 43(1):99-102.

ZHAO M D， HUANG X M， LIU Y Z， et al. Vertical transmission of new type flavivirus in egg-laying goose[J].JournalofSouthernAgriculture， 2012， 43(1):99-102. (in Chinese with English abstract)

IdentificationoflinearBcellepitopeforEproteinofduckTembusuvirus

ZHANG Lin1，2，YU Bin1，*， NI Zheng1，CHEN Liu1，YUN Tao1，YE Weicheng1，HUA Jionggang1，CUI Yanshun2，ZHANG Cun1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinarySciences，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China；2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This experiment was conducted to identify B cell epitope of E protein of duck Tembusu virus (DTMUV). In this study， a linear B cell epitope385LVGSGKGQI393(EP385) for DTMUV E protein were identified by truncated expressing the third domain of E protein (Domain III， DIII)， which is recognized by monoclonal antibody BD10 prepared by the purified DTMUV YY5 strain as antigen， and then by scanning the peptide library which containing 15 overlapping segment of truncated and fused expressed DIIIwith BD10. Then， the immunogenicity of EP385 was verified by fusion expressed inE.coliand immunized mice to prepare a polyclonal antibody which was confirmed to be capable of recognizing viral E protein. The identification of B cell epitope for the E protein of DTMUV may lead to the preparation of a DTMUV peptide vaccine and the development of specific serological diagnostic methods.

duck Tembusu virus; monoclonal antibody; peptide library scanning; epitope

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2009-2014

http://www.zjnyxb.cn

張琳，余斌，倪征，等. 鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細胞抗原表位的鑒定[J].浙江農業學報，2017，29(12)： 2009-2014.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.08

2016-08-22

國家重點研發計劃(2016YFD0500100)；浙江省自然科學基金(LY15C18002)；浙江省公益技術研究農業項目(2016C32070)

張琳(1986—)，女，黑龍江大興安嶺人，碩士研究生，主要從事動物檢疫與食品檢驗研究。E-mail: zhanglin_0109@126.com

*通信作者，余斌，E-mail: biogiant@126.com

S858.32

A

1004-1524(2017)12-2009-06

(責任編輯萬 晶)