白芨內生真菌的多樣性

席剛俊，李警保，史 俊，韓正敏，*

(1.江蘇農林職業技術學院 生物工程技術中心，江蘇 句容 211121；2. 南京林業大學 林學院，江蘇 南京 210037)

白芨內生真菌的多樣性

席剛俊1，李警保2，史 俊1，韓正敏2，*

(1.江蘇農林職業技術學院 生物工程技術中心，江蘇 句容 211121；2. 南京林業大學 林學院，江蘇 南京 210037)

為研究白芨內生菌的多樣性，從新鮮白芨根中提取內生真菌的DNA，構建ITS rDNA文庫，進行高通量測序和多項信息分析。結果顯示，白芨內生真菌主要屬于擔子菌門(83.4%)和子囊菌門(14.3%)，另外2.3%無法鑒定；擔子菌門、子囊菌門、接合菌門的菌根優勢度指數分別為0.834 1、0.142 6、0.000 3，無法鑒定的真菌菌根優勢度指數為0.022 9。綱、目的分類水平上，傘菌綱蠟殼菌目占83.4%，盤菌綱盤菌目占11.4%，錘舌菌綱柔膜菌目占2.1%，無法鑒定的占2.3%。科分類水平上，內生真菌主要屬于Serendipitacea(83.4%)和盤菌科(11.4%)。屬的分類水平上，梨形孢屬(Piriformospora)占83.4%。Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson 4種曲線分析結果顯示，白芨菌根內生真菌的多樣性呈均勻分布。

白芨；內生真菌；高通量測序；分類水平；多樣性

自然條件下，幾乎所有的蘭科植物都必須與菌根真菌形成共生關系才能完成正常的生長發育[1-2]。1840年，Link首次證實了蘭科植物根部有內生真菌，然后不斷有蘭科植物與菌根真菌共生關系的報道。形成蘭科菌根的真菌大部分屬于擔子菌(Basidiom-ycotina)，其無性態為絲核菌[3-4]。近年來研究發現，蘭科菌根真菌還有少部分為子囊菌(Ascomycotina)和接合菌(Zygomycotina)[5]。Rasmussen[6]研究表明，子囊菌也是蘭科的主要菌根真菌，而且越來越多的證據證實了這一觀點。隨著分子生物學在蘭科菌根真菌領域的應用，子囊菌開始受到廣泛關注[3]。

白芨[Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f. P.E.]為蘭科(Orchidaceae)白芨屬(BletillaReichb.f)植物，是我國傳統的中藥材，因其收斂止血、消腫生肌的功效而廣泛應用于臨床。內生真菌多樣性的研究對深入了解白芨具有重要意義。目前，我國主要以組織塊培養法從蘭科植物根部分離內生菌根真菌，這種方法無法從中分離出所有的內生菌根真菌，分離得到的真菌也無法確定是否為蘭科的內生菌根真菌。分子生物技術的應用克服了傳統方法的限制，可以從基因水平上研究菌根真菌的多樣性，確定菌根真菌的群落特征。本試驗以表面滅菌的白芨根為材料，提取菌根總DNA，采用高通量測序技術進行測序，利用PEAR將成對的Reads進行合并過濾，得到Clean Reads；根據Clean Reads對樣品進行序列可操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU)、物種特異性和多樣性分析，以獲得白芨根中內生真菌的多樣性信息，為進一步開展對白芨的研究提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花三叉白芨新鮮根部，2015年9月采自江蘇句容。

1.2 試驗方法

1.2.1 白芨根組織處理及表面消毒

選擇新鮮健康的白芨根，用滅菌的去離子水沖洗干凈，然后分次浸入75%乙醇45 s，2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min。消毒完成后，用滅菌的去離子水沖洗5～6次以徹底去除次氯酸鈉；最后超聲波處理2次，每次2 min，以去除菌根表面殘留的微生物DNA。用滅菌的濾紙吸干根表面的殘留水滴，然后用滅菌的解剖刀將根段切成0.5 mm左右的組織段。

1.2.2 菌根總DNA的提取

采用改良的CTAB法提取白芨菌根總DNA。具體步驟如下：

1)取0.5 g白芨根部組織，液氮研磨，磨碎物加入離心管；2)向離心管中加入600 μL預冷的CTAB-free，冰浴10 min，12 000g離心5 min，取上清液；3)加入600 μL預熱的2% CTAB提取緩沖液，65 ℃水浴45 min；4)冷卻至室溫后加入等體積的飽和酚，13 000g離心15 min，取上清液；5)加入與上清液等體積的酚、氯仿和異戊醇的混和液(體積比為25∶24∶1)，13 000g離心15 min，取上清液；6)加入與上清液等體積的氯仿、異戊醇的混和液(體積比為24∶1)，13 000g離心15 min，取上清；7)重復步驟6一次；8)加入0.1倍體積的5 mol·L-1的醋酸鉀和1倍體積的預冷異丙醇，混勻后置-20 ℃ 30 min或過夜，13 000g離心10 min，棄上清；9)加入400 μL預冷的70%乙醇使沉淀懸浮，13 000g離心5 min后棄上清液，重復2～3次，風干；10)加入25 μL的無菌高純水，4 ℃保存備用。

1.2.3 ITS rDNA文庫構建

取10 ng DNA模板，對目的區域真菌基因組轉錄間隔區1區(Internal transcribed spacer 1，ITS1)進行擴增。根據測序區域的不同，選擇對應區域引物。BITS (5′-ACCTGCGGARG GATCA-3′)和B58S3 (5′- GAGATCCRTTGYTRAAAGTT-3′)[7]。使用TaKaRa的EXtaq酶進行PCR擴增。

1.2.4 庫檢和高通量測序

使用Qubit 2.0稀釋文庫至1 ng·μL-1，對文庫的insert size采用Agilent 2100進行檢測，insert size符合預期后，進行Q-PCR(Bio-RAD CFX 96熒光定量PCR儀，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN)，對文庫的有效濃度進行準確定量。并對檢測合格的文庫進行高通量測序。

1.3 數據分析

利用軟件QIIME對Read 1和Read 2(分別從5’和3’端2個方向測序所得到的序列片段[8])拼接后的序列進行分析，包括OTUs的提取、聚類分析、Alpha多樣性分析等[9-11]。

OTU分析：采用Usearch61算法和UNITE真菌ITS數據庫(http://unite.ut.ee/)對OTU進行劃分，并對OTU代表序列的分類信息進行確定，在各個分類水平上統計各樣本的群落組成，并在真菌屬的水平上計算真菌的相對豐度。

聚類分析：對樣品的所有比對上參考數據庫的序列總數(Total aligned reads)進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類為OTUs。

Alpha多樣性分析：用QIIME軟件計算Shannon index、Chao1、Observed-species、Simpson指數。

2 結果與分析

2.1 菌根總DNA的提取結果

白芨菌根總DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。從圖1可以看出，1、2、5白芨菌根總DNA條帶清晰完整，符合后期進行菌根總DNA樣品基因建庫測序分析的要求。

2.2 序列長度分析

所測得的序列中能夠成功合成的成對序列數(total assembled reads)為31 380個，長度平均約256 bp，拼接后序列長度分布如圖2所示。

2.3 OTUs分析

2.3.1 OTUs統計

本試驗共獲得33 255條序列(拼接成功的序列總數)，與數據庫比對成功的序列總數為16 390，可分為32個OTUs(97%的序列相似性)。

M，DNA marker；1、2、3、4、5為白芨菌根總DNAM， DNA marker; 1， 2， 3， 4， 5， total DNA from Bletilla striata圖1 白芨菌根總DNA的電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis profile of total DNA from Bletilla striata

從表1可知，序列數最多的OTU登錄號是AF019636，序列數達到13 667，該菌株是Piriformosporaindica。其次是登錄號為FJ788739的UnculturedPezizaceae，序列數為1 858。序列數最少的有13個OTUs，它們序列數量均為2個。

2.3.2 OTUs豐度排秩分析

OTUs豐度排秩分析(Rank-Abundance)是依據每個OTU所含序列數的多少對OTUs進行排序，白芨菌根樣本里OTUs所包含的序列數分布情況可以通過Rank-Abundance直觀地看出，OUTs按包含的序列數目排秩在20～32之間時，曲線趨于平穩，表明OTUs分布均勻(圖3)。

圖2 ITS1序列長度Fig.2 Sequence length for ITS1 (bp)2.3 OTUs分析

表1OTUs統計分布表

Table1Statistical distribution table of OTUs

OTUID分類Classification序列數NumberofsequencesAF019636Piriformosporaindica13667FR734294Rhizoctoniasp．AG＿Fb2FJ478095Psathyrellaartemisiae2DQ235697Gloeotiniatemulenta348GQ153214Pezizomycotinasp112902AY748863Tubersp．2EF619742Unidentifiedsp．5EU750677Fusariumsp．0802371HM999902Pestalotiopsisclavispora26GU910884UnculturedXylariales4EU520606UnculturedAscomycota2HM162101UnculturedAscomycota2JN646040Fusariumsubglutinans2DQ068983Fusariumoxysporum2EU489956UnculturedAscomycota3FJ788738UnculturedPezizaceae9FJ788739UnculturedPezizaceae1858DQ420973Unculturedsoilfungus7JF945256Unculturedfungus208EU490138Unculturedzygomycete2GU569095Mucorsp．CBRF595EU003025Unculturedfungus4FJ439580Fungalsp．GMGC648FR863602Unculturedfungus2DQ420778Unculturedsoilfungus6FJ524314Unculturedendophyticfungus2GQ866223Unculturedfungus23AM260929Unculturedfungus11JN859419Ilyonectriamacrodidyma2HM030634Fungalsp．c879JQ723331Unculturedfungus2JN890532Unculturedfungus52

橫坐標表示OUTs按包含的序列數目排秩，縱坐標表示該OTU包含的序列數的相對豐度，曲線表示對應樣本的OTUs分布情況X-axis indicated that the OUTs was ranked according to the number of sequences， and the longitudinal coordinate indicated the relative abundance of the sequence numbers contained in the OTU， and Y-axis indicates the OTUs distribution of the corresponding samples圖3 OTUs豐度排秩圖Fig.3 Rank-Abundance of OTUs

2.3.3 白芨內生真菌餅圖分析

統計白芨菌根中的真菌，根據百分比作餅圖，從門、綱、目、科、屬不同分類水平進行統計(圖4)。門分類水平上，白芨內生真菌主要分布在擔子菌門(83.4%)，其次是子囊菌門(14.3%)，還有2.3%是無法鑒定的。綱分類水平上，內生真菌主要分布于傘菌綱(83.4%)，其次是盤菌綱(11.4%)，錘舌菌綱(Leotiomycetes)2.1%，其他綱0.7%，無法鑒定到綱的占2.3%。目分類水平上，內生真菌分布于蠟殼菌目(83.4%)，盤菌目(11.4%)，柔膜菌目(2.1%)，其他目(0.7%)，無法鑒定到目的占2.3%。科分類水平上，內生真菌主要分布于Serendipitaceae(83.4%)和盤菌科(11.4%)。從屬的分類水平來看，內生真菌主要為梨形孢屬(Piriformospora)(83.4%)。

2.3.4 白芨內生真菌優勢度指數分析

為更好地研究白芨菌根的優勢內生真菌，用公式di=Ni/Nt計算白芨菌根樣品中每個真菌的優勢度指數di；其中，Ni表示物種i在樣本中的個體數量，Nt則表示樣品中所有物種的個體數量的總和。優勢度指數可以體現某個物種在白芨菌根樣品中所占的比例。經計算，白芨菌根樣品在門水平下的優勢度指數為：擔子菌門(0.834 1)、子囊菌門(0.142 6)、接合菌門(0.000 3)、無法鑒定(0.022 9)。

2.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可以反映樣品內菌群的多樣性，包括菌種數目的均勻度以及菌種的類別豐富度。Alpha多樣性越高即真菌種類越豐富，真菌數目越均勻則表示此群落越穩定。本試驗采用Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson 4種指數對菌根樣品中的內生真菌多樣性進行分析(圖5)。結果顯示，剛開始的測序量遠不足以覆蓋樣品時，4種指數曲線均出現直線上升，隨著測序數量的增加，曲線斜率下降直至平穩，說明白芨菌根樣品測序合理，可以反映白芨菌根中內生真菌的多樣性。

圖4 白芨內生真菌餅圖分類結果Fig.4 Classfication results of pie chart of endophytic fungi from Bletilla striata

圖5Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson指數曲線

Fig.5Index curves of Shannon index， Chao1， Observed species and Simpson

3 結論與討論

自然條件下，由于培養條件等方面的影響，有85%～99.9%的微生物無法通過純培養獲得。因此，常規方法不能分離和鑒定生活在組織內部的微生物，而且分離獲得的微生物也不一定是天然的優勢菌群[12]。隨著第二代測序技術的日趨成熟，將Illumina高通量測序技術應用于蘭科菌根中內生真菌研究，可以克服組織塊分離培養工作量大，無法分離到菌根中不可人工培養的內生真菌，以及傳統分子生物學通量低等缺陷，從基因組水平解析內生真菌的分布情況。

陳澤斌等[13]采用高通量測序技術研究了鐵皮石斛葉片內生真菌的多樣性，獲得的有效序列數為41 361，OTU數為33，發現內生真菌裸胞殼屬(Emericellasp.)的構巢裸殼孢屬(Emericellanidulans)是鐵皮石斛葉片的優勢種群。陶剛[14]研究了貴州5個采樣點的白芨根組織分離的內生真菌，結果發現，所分離到的內生真菌有26種屬于子囊菌(占24.3%)，21種屬于擔子菌(占75.07%)。本試驗采用Illumina高通量測序技術研究白芨根部的內生真菌，證實了白芨根中確實存在內生真菌，內生真菌分屬于32個OTUs。從門的分類水平來看，白芨內生真菌主要分布在擔子菌門(83.4%)和子囊菌門(14.3%)，這和陶剛[14]的結果一致。從屬的分類水平來看，內生真菌主要分布于梨形孢屬(Piriformosporasp.)(83.4%)。而袁寧[15]、陶剛[14]、陳曉芳等[16]、蘇子敬等[17]雖然也分離到了擔子菌門的內生真菌，但未分離到梨形孢屬真菌，這可能與白芨的品種、采集地等因素有關[18]，生長在不同地方的同種植物，可能有不同的內生真菌[18]。從種的分類水平來看，白芨內生真菌主要屬于印度梨形孢(Piriformosporaindica)，因此，印度梨形孢為白芨根部的優勢真菌，這也與席剛俊等[19]的鑒定結果一致。

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DiversityofendophyticfungiinBletillastriata

XI Gangjun1， LI Jingbao2， SHI Jun1， HAN Zhengmin2，*

(1.Bio-EngineeringCenter，JiangsuPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry，Jurong211121，China; 2.CollegeofForestry，NanjingForestryUniversity，Nanjing210037，China)

To research the diversity of endophytic fungi inBletillastriata， DNA of endophytic fungi was extracted from the fresh root ofBletillastriata， and ITS rDNA library was constructed. Then， this library was analyzed by high-throughput Illumina sequencing technology and bioinformatics. The results showed that endophytic fungi ofBletillastriatawere mainly distributed in Basidiomycota (83.4%) and Ascomycota (14.3%)， the other 2.3% could’t be identified. Dominance index of endophytic fungi were Basidiomycota (0.834 1)， Ascomycota (0.142 6)， Zygomycota (0.000 3)， and unidentified (0.022 9). At Class and Order levels， the proportion of (Agaricomycetes) Sebacinales was 83.4%， (Discomycete) Pezizales was 11.4%， (Leotiomycetes) Helotiales was 2.1%， unidentified was 2.3%. At Family level，Serendipitaceawas 83.4% and Pezizaceae was 11.4%. At Genus level，Piriformosporawas 83.4%. Analysis of Shannon index， Chao1， Observed species and Simpson showed that diversity of endophytic fungi inBletillastriatawere uniformly distributed.

Bletillastriata; endophytic fungi; high-throughput sequencing; classification level; diversity

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2077-2083

http://www.zjnyxb.cn

席剛俊， 李警保， 史俊， 等. 白芨內生真菌的多樣性[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(12): 2077-2083.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.16

2017-08-21

江蘇省林業三新工程(LYSX[2015]02)；江蘇農林職業技術學院院內項目(2017KJ31)

席剛俊(1981—)，男，湖北仙桃人，碩士，助理研究員，從事鐵皮石斛、白芨病害研究。E-mail: 2469250487@qq.com

*通信作者，韓正敏，E-mail: zmhan@njfu.edu.cn

S567.23+9

A

1004-1524(2017)12-2077-07

(責任編輯侯春曉)