白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

薛 進(jìn)，李 靜，羊 健，唐 彥，梁 瑤，陳劍平，*，張恒木，*

(1.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 病毒研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310021； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

薛 進(jìn)1，2，李 靜2，羊 健2，唐 彥1，3，梁 瑤1，陳劍平2，*，張恒木2，*

(1.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 病毒研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310021； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

白背飛虱(SogatellafurciferaHorvth)作為一種遷飛性害蟲(chóng)，不僅自身危害水稻，而且以持久性方式傳播南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)。為了研究白背飛虱與SRBSDV之間的相互作用，需要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的酵母篩選文庫(kù)，試驗(yàn)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了白背飛虱cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，檢測(cè)分析顯示，白背飛虱初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為1.72×107CFU，cDNA插入片段主要分布在500～2 000 bp，重組率約為95.8%；次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為1.73×107CFU，cDNA插入片段主要分布在400～2 000 bp，重組率為100%；Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)庫(kù)容量約5.09×107CFU，插入片段大小在750～2 000 bp，重組率100%，再隨機(jī)挑選36個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序分析，所得結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示36個(gè)克隆中含有22個(gè)不同的基因，長(zhǎng)度在750～2 000 bp，這些分析表明，該文庫(kù)可以用于酵母雙雜交的后續(xù)篩選，為研究白背飛虱與SRBSDV之間的互作奠定了基礎(chǔ)。

白背飛虱；南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)；Gateway技術(shù)；酵母雙雜交；cDNA文庫(kù)

廣泛分布在東亞地區(qū)的為害水稻的白背飛虱(SogatellafurciferaHorvth)屬于半翅目(Hemiptera)同翅亞目飛虱科(Delphacidae)的遷飛性昆蟲(chóng)[1-3]，是最常見(jiàn)的3種稻飛虱之一，每年春天隨大氣環(huán)流方向從中南半島、東南亞和我國(guó)的海南島等地不斷地北上遷飛，直至我國(guó)東北，其初始遷入量與每年春夏暖濕氣流北上程度相關(guān)[4-5]，在南嶺以北地區(qū)不能越冬。水稻是其最適宜的寄主，其他寄主只能勉強(qiáng)完成一個(gè)世代[6-7]。白背飛虱可通過(guò)口針汲取韌皮部汁液直接為害水稻，另外還可以持久方式傳播南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)，且白背飛虱一旦獲毒，將終生攜毒和傳毒，但不經(jīng)卵垂直傳播[8]。在熱帶氣候地區(qū)如海南、福建、廣西等地區(qū)，白背飛虱以卵在禾谷類作物或雜草上越冬，第二年春天孵化的若蟲(chóng)可先在禾本科植物上取食繁殖，然后侵害農(nóng)作物，并向北方遷移，成為初始蟲(chóng)源，同時(shí)帶毒的白背飛虱成為SRBSDV的初始毒源。之前，我們測(cè)定并比較分析了多個(gè)中國(guó)和越南SRBSDV分離物基因組全序列[9-12]，構(gòu)建了SRBSDV基因的酵母表達(dá)文庫(kù)，探討分析了SRBSDV部分基因之間的互作[13-15]。SRBSDV能特異性地在白背飛虱體內(nèi)增殖并由其高效傳播，反映二者基因之間存在廣泛互作和適應(yīng)性進(jìn)化，但當(dāng)前這方面的研究仍然很缺乏。研究昆蟲(chóng)基因功能通常要采用cDNA文庫(kù)[16-20]，為了利用酵母雙雜交技術(shù)探索白背飛虱部分基因功能以及SRBSDV蛋白與白背飛虱間可能存在的互作關(guān)系，需要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的酵母篩選文庫(kù)，在此前的工作中我們已經(jīng)構(gòu)建了SRBSDV越南分離物的誘餌文庫(kù)，在這里需構(gòu)建白背飛虱的cDNA文庫(kù)作為靶標(biāo)文庫(kù)。但由于白背飛虱cDNA文庫(kù)中包含的目的基因大都是未知的，因而不能采用傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建方法，因而采用了Gateway技術(shù)構(gòu)建白背飛虱cDNA文庫(kù)。

Gateway技術(shù)就是利用λ噬菌體的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[21]的特異性重組特性，借由λ噬菌體整合酶和整合宿主因子的催化作用，將兩端含有重組位點(diǎn)的基因片段構(gòu)建到含有相應(yīng)重組位點(diǎn)的載體上，該技術(shù)可以同時(shí)將DNA序列構(gòu)建到各種兼容的載體上。與傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建方法相比，Gateway技術(shù)構(gòu)建重組載體時(shí)使用attBl和attB2接頭進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，能夠定向重組進(jìn)載體，而且無(wú)需進(jìn)行PCR、限制性酶切、連接等過(guò)程，簡(jiǎn)單快捷；使用毒性基因ccdB篩選陽(yáng)性克隆，因而陽(yáng)性克隆率較高，重組成功載體上的ccdB基因被cDNA置換，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到合適的宿主中后只有含重組子的菌株可以成活[22]；同時(shí)加入3個(gè)不同的閱讀框接頭，使插入的基因片段能夠包含3種不同的讀碼方式，從而確保了文庫(kù)的完整性和可靠性。在RT-PCR中獲得的cDNA兩端接上接頭5’-attBl及3’-attB2，它們?cè)诿傅拇呋屡c含有attP1、attP2的入門載體pDONR222發(fā)生BP重組反應(yīng)，cDNA位點(diǎn)特異性重組到pDONR222載體上，此時(shí)重組載體上的cDNA兩邊是attL1和attL2，在酶的作用下與含有attR1和attR2的酵母表達(dá)載體pGADT7-DEST發(fā)生LR重組反應(yīng)，文庫(kù)cDNA重組到pGADT7-DEST載體上得到相應(yīng)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒重組子。肖冬來(lái)等[23]利用該技術(shù)完成了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及分析，結(jié)果比較令人滿意。本試驗(yàn)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了白背飛虱cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)，旨在研究白背飛虱與SRBSDV之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 白背飛虱

本試驗(yàn)所用的白背飛虱為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群，采用健康水稻飼養(yǎng)，用白背飛虱的卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)等各個(gè)蟲(chóng)態(tài)的混合樣品提取總RNA。

1.1.2 載體與菌株

載體構(gòu)建時(shí)用到的入門載體為pDNOR222，其通用引物正向?yàn)镸13F(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)，反向?yàn)镸13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)；酵母表達(dá)載體為pGADT7-DEST，其通用引物正向?yàn)門7(5’-TAATACGACTCACTATAG GGC-3’)，反向?yàn)?-AD(5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’)；大腸埃希菌菌株DH10B，酵母菌株Y187。

1.1.3 attB1構(gòu)庫(kù)接頭

根據(jù)構(gòu)庫(kù)需要而設(shè)計(jì)的構(gòu)庫(kù)流程，在合成cDNA第二鏈后需在cDNA兩頭連接上aTTB1接頭，在此試驗(yàn)中用到3種attB1接頭，分別是：

Reading Frame α 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3’，

(RFα)3’-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5’；

Reading Frame β 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA-3’ ，

(RFβ)3’-CCCCT GTTGAAACATGTTTTTTCAACCTp-5’；

Reading Frame γ 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAA AAAAGTTGGAA-3’，

(RFγ)3’-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCTTp-5’。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建方法

本研究利用Gateway技術(shù)構(gòu)建白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的大致流程為：提取總 RNA→分離mRNA→合成cDNA第一條鏈→合成cDNA第二條鏈→連接attB1接頭→cDNA分級(jí)→BP重組反應(yīng)將cDNA構(gòu)建到pDNOR222入門載體→轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞→LB重組反應(yīng)將cDNA重組到pGADT7-DEST表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞→鑒定文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.1 Trizol法提取白背飛虱總RNA

總RNA提取主要參照Invitrogen公司說(shuō)明書(shū)，采用Trizol法提取水稻葉片或白背飛虱總RNA， RNase free H2O中溶解，-80 ℃保存。

1.2.2 分離mRNA

參考Invitrogen公司說(shuō)明書(shū)，利用FastTrack?2.0 Kit進(jìn)行mRNA分離，溶于50 μL DEPC-H2O中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 pDNOR222-cDNA 重組子構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)流程和實(shí)驗(yàn)方法參照CloneMiner說(shuō)明書(shū)(Invitrogen)進(jìn)行。合成cDNA第一鏈，然后合成cDNA的第二鏈，將合成得到的cDNA與attB1重組接頭進(jìn)行連接。

連接完成后分級(jí)分離收集cDNA(用Invitrogen公司產(chǎn)品FastTrack? 2.0 Kit分級(jí)分離收集cDNA，操作步驟參照其說(shuō)明書(shū))。所得含接頭的cDNA進(jìn)行BP重組反應(yīng)。

BP重組所得產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10， 取10 μL轉(zhuǎn)化后的菌液梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍后，從中取出50 μL涂布LB(含Kan+，50 mg·mL-1)平板，第2天計(jì)數(shù)(選擇3個(gè)梯度平板中克隆生長(zhǎng)清晰，分布均勻的平板準(zhǔn)確計(jì)數(shù))，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%保存于-80 ℃冰箱。

白背飛虱cDNA初級(jí)文庫(kù)文庫(kù)質(zhì)量鑒定，文庫(kù)庫(kù)容量計(jì)算公式：文庫(kù)滴度(CFU·mL-1)=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積(mL)；

文庫(kù)的總?cè)萘?Total CFU)=文庫(kù)滴度(CFU·mL-1)×該文庫(kù)總體積(mL)；

重組率和插入片段長(zhǎng)度鑒定：隨機(jī)挑取48個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

抽提初級(jí)cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒，將抽得的初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒用微量濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度，然后用滅菌ddH2O按比例稀釋至300 ng·μL-1。建立LR重組反應(yīng)將白背飛虱cDNA重組到pGADT7-DEST載體上，參照上述BP重組反應(yīng)步驟得到重組cDNA。

電轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10B，加入2 mL SOC 液體培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇1 h，轉(zhuǎn)化液用SOC 液體培養(yǎng)基稀釋10 倍后全部涂于大量的LB 平板(含100 mg·mL-1Amp+)，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌操作刮下菌苔，懸浮于20%甘油保存液中，分裝后-80 ℃保存，此即為次級(jí)文庫(kù)。取10 μL菌液梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，從中取出50 μL涂布LB(含Amp+，100 mg·mL-1)平板，第2天計(jì)數(shù)(選擇3個(gè)梯度平板中克隆生長(zhǎng)清晰，分布均勻的平板準(zhǔn)確計(jì)數(shù))，用于庫(kù)容量鑒定。然后鑒定次級(jí)文庫(kù)質(zhì)量，PCR引物使用酵母載體通用引物組合F/R∶5’-T7/3’-AD。

1.2.5 Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)制備

Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞制備：用醋酸鋰法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后用PEG/LiAc法將白背飛虱酵母雙雜交次級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，在SD/-Leu固體平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，直至長(zhǎng)出克??；同時(shí)取10 μL菌液稀釋10倍、100倍、1 000倍后取100 μL涂布SD/-Leu固體平板用于計(jì)算轉(zhuǎn)化后文庫(kù)克隆數(shù)。

將長(zhǎng)有菌落的SD/-Leu固體平板于4 °C預(yù)冷3～4 h，然后用含25%甘油的YPD液體冷卻培養(yǎng)基刮菌，調(diào)節(jié)菌液濃度至>1×107cell·mL-1，每管1 mL分裝，保存于-80 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 白背飛虱總RNA

RNA質(zhì)量是文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量關(guān)鍵因素之一，提取白背飛虱總RNA是構(gòu)建其文庫(kù)的第一步，本試驗(yàn)中采用了Trizol法提取白背飛虱總RNA，mRNA的分離使用了Invitrogen公司產(chǎn)品FastTrack?2.0 Kit。用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的白背飛虱總RNA可以看到清楚的3條帶，即28S、18S 和5S RNA，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量較好，純化的mRNA大小主要集中在750～2 000 bp(圖 1)。

M，DNA ladder; 1，Total RNA; 2，mRNA圖1 白背飛虱總RNA及mRNA電泳Fig.1 Electrophoresis of Sogatella furcifera total RNA

2.2 庫(kù)容量鑒定

2.2.1 初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量及檢測(cè)

本試驗(yàn)構(gòu)建的初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)中，在稀釋1 000倍的平板上生長(zhǎng)了86個(gè)單克隆(圖 2)，根據(jù)庫(kù)容量公式計(jì)算得出：文庫(kù)滴度為1.72×106CFU·mL-1，文庫(kù)庫(kù)容量為1.72×107CFU，即初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為1.72×107CFU。從圖3可以看出，白背飛虱初級(jí)文庫(kù)cDNA插入片段主要分布在500～2 000 bp，平均插入片段大于1 000 bp，具有良好的多態(tài)性。在所檢測(cè)的48個(gè)轉(zhuǎn)化子中有2個(gè)為空載體，根據(jù)公式：文庫(kù)重組率=(有插入片段的轉(zhuǎn)化子/總轉(zhuǎn)化子)×100%，計(jì)算出文庫(kù)的重組率約為95.8%，所以插入片段長(zhǎng)度和重組率均符合文庫(kù)構(gòu)建要求。

稀釋倍數(shù)1∶1 000；涂布量50 μL；單克隆數(shù)86Dilution factor was 1∶1 000; Coating weight was 50 μL; Number of clones was 86圖2 初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)Fig.2 Calculation of the primary library titer

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder；泳道1～24為擴(kuò)增產(chǎn)物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-24， Amplification products by PCR圖3 初級(jí)文庫(kù)PCR檢測(cè)Fig.3 Detection of primary library by PCR

2.2.2 次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量及檢測(cè)

本試驗(yàn)構(gòu)建的初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)中，在稀釋100倍的平板上生長(zhǎng)了867個(gè)單克隆(圖4)，根據(jù)庫(kù)容量公式計(jì)算得出:文庫(kù)滴度為1.73×106CFU·mL-1，文庫(kù)庫(kù)容量為1.73×107CFU，即次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為1.73×107CFU。從圖5可以看出，白背飛虱次級(jí)文庫(kù)cDNA 插入片段主要分布在400～2 000 bp，平均插入片段大于900 bp，具有良好的多態(tài)性。在所檢測(cè)的24個(gè)轉(zhuǎn)化子中沒(méi)有空載體，因而次級(jí)文庫(kù)的重組率為100%，所以插入片段長(zhǎng)度和重組率均符合文庫(kù)構(gòu)建要求。

2.2.3 Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)庫(kù)容量及檢測(cè)

一個(gè)合格的cDNA文庫(kù)其庫(kù)容量要求達(dá)到1×106CFU以上，本試驗(yàn)構(gòu)建的Y187酵母菌株白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)中，在稀釋1 000倍的平板上生長(zhǎng)了509個(gè)單克隆(圖6)，根據(jù)庫(kù)容量公式計(jì)算得出：文庫(kù)滴度為5.09×106CFU·mL-1，文庫(kù)庫(kù)容量為5.09×107CFU，即白背飛虱酵母雙雜交文庫(kù)庫(kù)容量約為5.09×107CFU，符合酵母文庫(kù)篩選試驗(yàn)的要求。

稀釋倍數(shù)1∶100；涂布量50 μL；單克隆數(shù)867Dilution factor was 1∶100; Coating volumn was 50 μL; Number of clones was 867圖4 酵母文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)Fig.4 Calculation of the secondary library titer

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder; 泳道1～24為部分文庫(kù)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-24， Amplification products by PCR圖5 次級(jí)文庫(kù)PCR檢測(cè)Fig.5 Detection of secondary library by PCR

稀釋倍數(shù)1∶1 000；涂布量100 μL；單克隆數(shù)509Dilution factor was 1∶1 000; Coating volumn was 100 μL; Number of clones was 509圖6 Y187酵母文庫(kù)庫(kù)容量檢測(cè)Fig.6 Calculation of the Y187 cDNA library titer

隨機(jī)挑選72個(gè)單克隆分別用通用引物進(jìn)行PCR分析，結(jié)果顯示72個(gè)克隆均含有重組片段，重組率100%，達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建要求，插入片段的大小平均約1 000 bp(圖 7)。再隨機(jī)挑選36個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序所得結(jié)果用BLAST對(duì)比分析，結(jié)果表明36個(gè)克隆中含有22個(gè)不同的基因(表1)，長(zhǎng)度在750～2 000 bp，這些分析表明該文庫(kù)可以用于酵母雙雜交的后續(xù)篩選。

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder; 泳道1～12為部分文庫(kù)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-12， Amplification products of cDNA clones by PCR圖7 Y187酵母cDNA文庫(kù)PCR檢測(cè)Fig.7 Detection of Y187 cDNA library by PCR

表1二十二個(gè)基因測(cè)序分析結(jié)果

Table1The results of sequencing and analysis of 22 genes

編號(hào)No．同源基因序列號(hào)SerialnumberofHomologousgeneE值Evalue基因注釋Geneannotation1HM60072310LaodelphaxstriatellusstrainYunnancloneLsCarE1carboxylesterase(LsCarE)2HM16012210Sogatellafurciferaisolatebb4cytochromeoxidasesubunitIgene3HM23375210Sogatellafurciferaisolate4116SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial4HF95118411e?83PantroglodytesBACcloneRP43?86L11fromchromosome75LT72725710001Xenopus(Silurana)tropicalisG?2andS?phaseexpressed1(gtse4)，mRNA6FJ36069510Laodelphaxstriatellusmitochondrion，completegenome7KX67054410Laodelphaxstriatellusputativemucin?likeproteinmRNA，completecds8XM＿01526911819e?75ChrysomelatremulaeribosomalproteinL21(RpL22)mRNA，complete9BT05849812e?12Arabidopsisthalianachromosome0，completesequence10KC51291510SogatellafurciferaisolateWBPHYNmitochondrion，completegenome11KX24592710Sogatellafurcifera16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial12HM23374012e?130Arcofaciesmaculatipennisisolate816SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial13AY16696918e?179Oryzasativa(indicacultivar?group)resistance?relatednon?codingRNA(nc1)，completesequence14XM＿01526911819e?75PREDICTED：Diachasmaalloeum60SribosomalproteinL21(LOC107046495)，mRNA15HM23380012e?179Sardiarostrataisolate23416SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial16KX24596810Matutinusmelichari16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial17JX88006818e?179Laodelphaxstriatellusmitochondrion，completegenome18HM23375015e?156Nilaparvatamuiriisolate2716SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial19KX24594111e?162Himeunkatateyamaella16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial20HM23376210Matutinusmelichariisolate6916SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial21KX24595512e?179Sardiarostrata16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial22XM00113654220Unknown1

3 討論

本試驗(yàn)構(gòu)建了白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。首先在總RNA提取中，電泳檢測(cè)提取的白背飛虱總RNA可以看到清楚的28S、18S 和5S RNA條帶，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量較好，純化的mRNA大小也主要集中在750～2 000 bp，完全滿足了下游操作需要。在逆轉(zhuǎn)錄合成了雙鏈cDNA后，巧妙地利用了Gateway技術(shù)中λ噬菌體的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，借由λ噬菌體整合酶和整合宿主因子的催化作用，將兩端含有重組位點(diǎn)的基因片段構(gòu)建到含有相應(yīng)重組位點(diǎn)的載體上，這樣充分地將cDNA中的未知基因連接到載體上，避免了需要設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，也保證所插入cDNA 片段的完整性，在對(duì)文庫(kù)質(zhì)量及庫(kù)容量的檢測(cè)中充分體現(xiàn)了這些優(yōu)點(diǎn)，重組率和插入片段長(zhǎng)度均符合文庫(kù)構(gòu)建的要求。當(dāng)然，由于白背飛虱總RNA提取中沒(méi)有去掉飛虱腸道中的取食物，可能會(huì)殘留部分水稻等食物，構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)粒中也許含有水稻等物種的其他基因，但在后期的篩選中可以通過(guò)測(cè)序等手段去除這些干擾。

目前，國(guó)內(nèi)外曾報(bào)道過(guò)用各種不同方法構(gòu)建白背飛虱[24]、灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[25]和褐飛虱(Nilaparvatalugens)[26]的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，用于研究昆蟲(chóng)基因功能、介體昆蟲(chóng)與植物病毒的互作[15，27]。本試驗(yàn)中利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了質(zhì)量鑒定，結(jié)果顯示白背飛虱cDNA初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為5.16×107CFU，次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為1.73×107CFU，白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)庫(kù)容量約為5.09×107CFU，重組率和庫(kù)容量均達(dá)到了文庫(kù)構(gòu)建要求，插入片段位于400～2 000 bp。在對(duì)含有的基因含量進(jìn)行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)基因豐富度較高，基本符合預(yù)期目標(biāo)，說(shuō)明此方法是方便快捷可行的，達(dá)到酵母文庫(kù)篩選所要求的文庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于與已轉(zhuǎn)入Y2H Gold菌株中的SRBSDV文庫(kù)進(jìn)行Mating雜交，篩選互作蛋白等工作。

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Constructionofyeasttwo-hybridcDNAlibraryofwhite-backedplanthopper(Sogatellafurcifera)

XUE Jin1，2， LI Jing2， YANG Jian2， TANG Yan1，3， LIANG Yao1， CHEN Jianping2，*， ZHANG Hengmu2，*

(1.HunanProvincialKeyLaboratoryforBiologyandControlofPlantDiseasesandInsectPests，InstituteofVirology，CollegeofPlantProtection，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China; 2.InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofOrientScience&Technology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

White-backed planthopper (SogatellafurciferaHorvth) is a major migratory pest that feed on rice plants and transmitSouthernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV) in a persistent manner. In order to screen interactions between the genes of WBPH and SRBSDV， a cDNA expression library of WBPH was firstly constructed into the yeast plasmids using Gateway technique in this study. The results showed that the primary library consisted of 1.72×107CFU (colony-forming units)， the sizes of most inserts were 500-1 500 bp in length， and the recombinant frequency was about 95.8%; the titer of secondary cDNA library was 1.73×107CFU， the sizes of most inserts were 400-2 000 bp in length， and the recombinant frequency was 100%; the titer assays showed that the cDNA library was approximately 5.09×107CFU for yeast two-hybrid cDNA library of Y187; PCR assays showed that the average length of insertions were 750-2 000 bp and the recombinant frequency of the cDNA library was high up to 100%， random sequence analysis of 36 clones showed that 22 of the clones were different in GenBank. These results consistently indicated that the cDNA library could be used for screening interactions in the yeast two hybrid experiments， which laid the foundation for studying on the interactions between white-backed planthopper and SRBSDV.

white-backed planthopper (SogatellafurciferaHorvth);Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV); Gateway technique; yeast two-hybrid; cDNA library

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2060-2067

http://www.zjnyxb.cn

薛進(jìn)，李靜，羊健，等. 白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(12)： 2060-2067.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.14

2017-05-09

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16C0773)

薛進(jìn)(1980—)，男，湖南桃江人，博士，講師，主要從事昆蟲(chóng)病毒學(xué)研究。E-mail: xuejin@hunau.edu.cn

*通信作者，陳劍平，E-mail: jpchen2001@126.com；張恒木，E-mail: zhhengmu@tsinghua.org.cn

S435.11

A

1004-1524(2017)12-2060-08

(責(zé)任編輯張 韻)