腫瘤干細胞標記物CD133和CD44在卵巢癌組織的表達及其臨床意義

童文先 何安兵 張 濤 鎮鴻燕 劉愛華 彭秀蘭 王 虎 田 倩 李曉光

(武漢市第五醫院腫瘤1科，湖北 武漢 430050)

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腫瘤干細胞標記物CD133和CD44在卵巢癌組織的表達及其臨床意義

童文先 何安兵 張 濤1鎮鴻燕2劉愛華 彭秀蘭 王 虎 田 倩 李曉光

(武漢市第五醫院腫瘤1科，湖北 武漢 430050)

目的研究卵巢癌組織中CD133、CD44的表達及其與卵巢癌患者預后的關系。方法免疫組化法檢測CD133、CD44在卵巢癌組織中的表達水平，分析其表達水平與卵巢癌臨床病理指標的相關性。結果CD133在卵巢癌組中陽性表達率分別為47.22%(17/36)，CD44陽性表達率分別為52.78%(19/36)，差異有統計學意義(P<0.05)。CD133和CD44的表達均與臨床病理分期和淋巴結轉移有顯著相關性(P<0.05)。Spearman相關性分析顯示CD133表達與CD44的表達有相關性(r=0.536，P=0.000)。結論CD133和CD44的高表達可能與卵巢癌的發生、發展有一定關系。

卵巢癌；腫瘤干細胞；CD133；CD44

卵巢癌是女性生殖系統3大惡性腫瘤之一，死亡率卻高居婦科腫瘤首位，城市女性中卵巢癌發病率排在婦科腫瘤第一位〔1〕。美國癌癥協會最新預測美國2015年、2016年的卵巢癌的發病人數為21 290、22 280，死亡人數為14 180、14 240〔2，3〕；病死率高達66.6%、64.49%。由于卵巢癌病因不易發現，早期癥狀不夠典型，約70%患者初次診斷就已經為晚期，且其中約70%患者兩年內就會出現復發和轉移〔4〕。惡性腫瘤中存在少部分具有干細胞性質的細胞群，具有自我更新能力，會導致腫瘤的無限生長；且具有多向分化潛能，導致腫瘤細胞的異質性；常處于靜止休眠狀態，對放化療具有耐受能力。這些腫瘤干細胞是腫瘤發生、發展的根源，也是臨床上導致腫瘤復發、轉移的根本原因。因此，腫瘤干細胞的研究具有理論和實踐的雙重指導意義。五次跨膜糖蛋白CD133(又稱Prominin-1)，是多種腫瘤干細胞的重要表面標記〔5〕。CD44是一種分布極廣泛黏附分子，是細胞表面跨膜糖蛋白，主要功能為參與細胞、細胞以及細胞、基質之間的特異性粘連過程〔6〕。目前，已有研究將CD133、CD44應用在骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕、結直腸癌〔10〕、舌鱗狀細胞癌〔11〕、胃腺癌〔12〕中，但是在卵巢癌中的聯合研究較少。本研究以卵巢癌為研究對象，通過免疫組織化學方法觀察干細胞標記物CD133和CD44的表達情況，并探討二者臨床表達的相關性，為以腫瘤干細胞為靶向的卵巢癌治療方案提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 收集2013年1月至2016年8月在武漢市第五醫院腫瘤科收治的具有完整病理資料的原發性卵巢癌手術切除標本36例(患者在手術前均未進行放、化療及其他抗腫瘤治療)。入選病例隨訪至患者死亡或截止至2016年8月31日，隨訪時間為3～29個月。患者年齡37～85歲，平均52.8歲；根據國際婦產科學聯盟(FIGO)關于卵巢癌的手術、病理分期的標準進行分類，早期(FIGO Ⅰ+Ⅱ期)卵巢癌11例，晚期(FIGO Ⅲ+Ⅳ期)卵巢癌25例；漿液性癌26例，黏液性癌5例，宮內膜樣癌2例，透明細胞癌3例。患者伴有腹腔臟器及淋巴結轉移者16例，有腹水者21例。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1試劑 一抗兔抗人CD133抗體、小鼠抗人CD44抗體、二抗為酶標羊抗鼠/兔IgG合物，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2免疫組化 石蠟包埋組織切片，用二甲苯、酒精進行脫蠟，蒸餾水漂洗5 min。3%過氧化氫常溫滅活10 min，水洗。通過EDTA稀釋10倍，微波爐大火煮約7～8 min，室溫冷卻5 min，再大火煮約7～8 min進行微波熱修復。冷卻0.5 h至室溫后，滴加5%BSA，37℃溫箱孵育0.5 h(不洗)做封閉處理。滴加一抗，37℃溫箱孵育2.0 h，PBS洗5 min×3次。抗體稀釋濃度比為1∶100。滴加生物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃溫箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。滴加SABC，37℃溫箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。再進行DAB顯色，復染，返藍，封片，用顯微鏡觀察結果。

1.3結果判定 CD133、CD44均主要著色于胞質和/或胞膜，按染色強度的差異，DAB陽性經過染色成為棕色或黃色。在4個不同高倍視野下觀察200個癌細胞，計算陽性細胞數量，如陽性細胞數>10%，則為陽性。若≤10%，則為陰性。該判定由3位病理科醫生獨立進行觀察判斷，若判斷不一致，則可對切片共同進行觀察。

1.4統計學分析 應用SPSS20.0軟件。計量資料分析采用t檢驗，計數資料分析應用χ2檢驗；以Cox比例風險回歸模型作多因素分析。

2 結 果

2.1隨訪結果 本組病例均采用電話或定期門診隨訪，36例患者均得到隨訪，中位隨訪時間18個月(2～30個月)，12例死亡，8例無瘤生存，16例帶瘤生存。

2.2卵巢癌組織中CD133和CD44的表達 36例卵巢癌組織中，共16例(44.44%)有轉移。CD133陽性表達率47.22%(17/36)(圖1)；CD44陽性表達率52.78%(19/36)(圖2)。

2.3CD133和CD44表達與卵巢癌臨床特征的關系 四種卵巢癌中常見的組織學分型間CD44陽性率無顯著差別(P>0.05)，四種組織學分型間CD133陽性率無顯著差別(P>0.05)，見表1。CD133陽性組淋巴結轉移率與陰性組差異有統計學意義(P<0.05)。CD44陽性組淋巴結轉移率與陰性組差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4原發性卵巢癌中腫瘤表面標記物CD133與CD44表達的相互關系 本研究顯示原發性卵巢癌中腫瘤表面標記物CD133與CD44的表達之間呈正相關性(r=0.536，P<0.05)，表2。

2.5Cox回歸分析 將卵巢癌患者年齡(分為≥50歲組與<50歲組)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ期組與Ⅲ+Ⅳ期組)、淋巴結轉移(轉移組與無轉移組)、腹水(有腹水組與無腹水組)、CD133表達(陽性組與陰性組)、CD44表達(陽性組與陰性組)等相關因素引入Cox模型進行分析，CD133、CD44及FIGO分期是影響卵巢癌患者預后的獨立因素。見表3。

圖1 CD133陽性表達情況(DAB，×200)

圖2 CD44陽性表達情況(DBA，×200)

變量nCD133陽性P值CD44陽性P值年齡(歲)>005>005≤50167(4375)8(5000)>502010(5000)11(5500)組織類型(n)>005>005漿液型2611(4230)13(5000)黏液型53(6000)2(4000)內膜樣21(5000)2(100．00)透明型32(6667)2(6667)臨床分期(n)<005<005Ⅰ～Ⅱ115(4545)7(6364)Ⅲ～Ⅳ2512(4800)12(4800)淋巴結轉移(n)<005<005有168(5000)12(7500)無209(4500)7(3500)腹水(n)<005<005有2112(5714)13(6190)無155(3333)6(4000)

表2 CD133與CD44表達的關系(n)

表3 36例卵巢癌患者多因素分析

3 討 論

所謂腫瘤干細胞，指的是腫瘤中少數具有“干細胞性質”的細胞。這些細胞常處于細胞周期的G0～G1期，放、化療對其很難起作用，它們可不斷自我更新，并持續分化出具有不同增殖活性的腫瘤細胞〔5〕。根據其這一特質，常規治療很難根除腫瘤干細胞，這是導致腫瘤復發、轉移和影響治療效果的重要原因。現在，已有較多研究將CD133和CD44用作腫瘤干細胞分離、鑒定等過程中的標志物。CD133又可稱為Prominin-1，是Prominin家族的一位成員，具有五個跨膜結構域和兩個糖基化膜外環的結構〔13，14〕。近年來，多項研究證明CD133是多種惡性腫瘤干細胞普遍的表面標記物，雖然我們對其功能并不完全了解，但是已有研究顯示，CD133的某些功能可能對腫瘤干細胞性質的維持和分化發揮了相當重要的作用。CD44是細胞表面跨膜糖蛋白，是一種分布極廣泛黏附分子，其主要功能為參與細胞、細胞以及細胞、基質之間的特異性粘連過程。目前，CD44蛋白作為多種已知腫瘤干細胞的標記物已經有了相當的研究成果，越來越受到與生命科學科研工作者的重視。

此前，已有研究將CD133和CD44聯合用于研究骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、舌鱗狀細胞癌〔11〕、肺癌〔15〕組織的表達情況，證實CD133、CD44可以作為胃癌、舌癌和肺癌患者早期診斷的腫瘤標志物。本研究發現CD133和CD44這兩種蛋白在卵巢癌組織中的表達在某種程度上可以體現腫瘤干細胞的表達和分布。根據這兩種標記物的表達情況，能對患者的預后進行較為可靠的預測，指導臨床實踐。本研究還發現，CD44陽性的腫瘤干細胞在特殊的微環境作用下，能夠不斷的生長并向外遷移；并且分化越差的腫瘤，這種團簇狀的腫瘤干細胞群越多，腫瘤生長更快，預后更差。CD133蛋白的表達與卵巢癌患者的臨床分期及轉移關系有著緊密的聯系，若CD133蛋白表達陽性率較高，患者臨床分期相對較晚，就較容易出現淋巴結轉移。

本研究由于病例數較少，缺乏隨機對照，且對CD133和CD44陽性細胞的特點及轉移機制的研究不足，對卵巢癌患者臨床預后的指導意義說明力度相對較弱，需要研究者進一步擴大樣本量進行研究，提高臨床的指導性。另外，需要找到在如血液等反映患者腫瘤干細胞狀態的相關標記物，即時知曉腫瘤發展狀態，為臨床治療和預后提供及時的信息，為卵巢癌患者診斷、治療和預后提供保障。這些需要在后續研究中進一步探討。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6098-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.040

湖北省衛生計生科研基金資助(WJ2015MB245)

1 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腫瘤中心

2 江漢大學醫學院

何安兵(1963-)，男，主任醫師，主要從事腫瘤放療學研究。

童文先(1981-)，女，主治醫師，主要從事腫瘤放療學研究。

〔2017-09-26修回〕

(編輯 袁左鳴)