缺氧誘導因子-2α對基質金屬蛋白酶-2啟動子活性的轉錄調控作用

李 娜 梁文輝 史 齊 王建強 王志慧 (新鄉醫學院,河南 新鄉 453003)

缺氧誘導因子-2α對基質金屬蛋白酶-2啟動子活性的轉錄調控作用

李 娜 梁文輝1史 齊 王建強 王志慧 (新鄉醫學院,河南 新鄉 453003)

目的克隆基質金屬蛋白酶(MMP)-2基因5′上游1.7 kb啟動子，構建啟動子-螢光素酶報告基因載體pGL3-MMP-2 pro，探討缺氧誘導因子(HIF)-2α對MMP-2啟動子轉錄活性的影響。方法采用PCR擴增MMP-2啟動子上游區域基因片段，插入到含有螢光素酶報告基因的載體PGL3-basic中構建重組子，經雙酶切和測序鑒定后，將重組子轉染MCF-7細胞，通過雙螢光素酶活性分析HIF-2α對MMP-2啟動子轉錄活性的影響。結果PCR擴增的1.7 kb片段經測序正確無誤，pGL3-MMP-2 pro轉染MCF-7細胞48 h后，雙螢光素酶活性測定結果顯示加CoCl2誘導的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α組啟動子活性顯著高于pGL3-MMP-2 pro組、陰性對照組和空白對照組(均P<0.05)。結論HIF-2α促進了MMP-2啟動子轉錄活性。

缺氧誘導因子-2α；基質金屬蛋白酶-2；啟動子；MCF-7細胞

缺氧誘導因子(HIF)-2是調節氧穩態的核心轉錄因子，在腫瘤形成和發展中發揮重要作用?；|金屬蛋白酶(MMP)-2，又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶，在惡性腫瘤的侵襲轉移及間質血管生成過程中起重要作用〔1〕。關于惡性腫瘤中HIF-2α與MMP-2表達的關系及MMP-2是否為HIF-2α促進細胞侵襲、轉移的作用靶點，目前相關報道較少。我們的前期研究發現HIF-2α的表達與乳腺癌的侵襲轉移之間存在明顯相關性，并且HIF-2α能夠上調MMP-2的表達〔2，3〕。本研究在構建MMP-2啟動子報告載體基礎上，探討乳腺癌細胞中HIF-2α對MMP-2啟動子轉錄活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司，HIF-2α單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司(Neomarkers產品)，人成纖維細胞(NIH3T3)和乳腺癌細胞(MCF-7)購于中科院上海細胞庫；pGL3-basic螢光素酶報告基因系統來自Promega公司。

1.2PCR擴增MMP-2 pro cDNA 根據文獻報道〔4〕，設計MMP-2 pro引物序列，上游：5′-ATGTCTGGTACCACACCCACCAGACAAGCCT-3'；下游：5'-ATAGTACTCGAG AAGCCCCAGATGCGC AGCCT-3'，交上海生工生物技術有限公司合成，LA Tag酶PCR擴增 MMP-2 pro cDNA。

1.3pMD18-T-MMP-2 pro的構建 酚氯仿抽提MMP-2 pro cDNA PCR擴增產物，將純化回收的 MMP-2 pro cDNA連接到pMD18-T上，EcoRv為pMD18-T上的克隆點，轉化DH5α感受態大腸桿菌，經氨芐青霉素進行抗性篩選，挑選單克隆擴增，提取質粒，Kpn I/Xho Ⅰ雙酶切鑒定。將鑒定連接成功的質粒菌液送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.4pGL3-MMP-2 pro載體構建 用限制性內切酶Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切pMD18-T-MMP-2 pro，切取約1.7kb片段，Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ進行雙酶切質粒pGL3-basic，將純化回收的MMP-2 pro cDNA克隆于pGL3-basic的Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ之間。轉化DH5α感受態大腸桿菌，經氨芐青霉素進行抗性篩選，挑選單克隆擴增，提取質粒，進行酶切鑒定。將鑒定連接成功的質粒菌液送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.5乳腺癌MCF-7細胞的培養和轉染 采用脂質體轉染法(Promega)，將乳腺癌MCF-7細胞分別以5×103個細胞/孔接種于6孔板中，37℃，5%CO2培養箱中孵育過夜，至細胞密度長至60%～80%，吸去DMEM+10%FBS培養液，DMEM培養液清洗，1 ml DNA/脂質體復合物加入每孔，37℃5%CO2培養箱中溫育1 h，2 ml 10%FBS DMEM培養液加入每孔，37℃，5%CO2培養箱中孵育。

1.6雙螢光素酶活性測定 按照螢光素酶檢測系統(Promega)說明進行，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗轉染48 h后的細胞，每孔加入300 μl 1倍裂解液，將50 μl螢光素酶試劑Ⅱ加入到1.5 ml EP管中，取10 μl 細胞裂解液加入上述EP管中，吹打混勻，置于檢測儀測定pGL3中的螢光素酶活性及內參海腎螢光素酶活性。二者比值為被檢測質粒轉染細胞后所測得的螢光素酶相對活性。分組如下：①未轉染的MCF-7細胞(空白對照組)；②只轉染pGL3質粒的MCF-7細胞(陰性對照組)；③只轉染pGL3-MMP-2 pro質粒的MCF-7細胞；④CoCl2處理的轉染pGL3-MMP-2 pro質粒的MCF-7細胞。以pGL3-MMP-2 pro的活性作為100%，各組重復測3次。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1PCR擴增 MMP-2 pro cDNA 采用PCR方法擴增出MMP-2 pro cDNA序列，將擴增的 MMP-2 pro cDNA基因PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，電泳圖譜見圖1，可見一長約1.7 kb清晰條帶，其基因片段大小與預計相符，表明已獲得MMP-2 5′啟動子非編碼區基因片段。

2.2MMP-2 pro cDNA連接到pMD-18T載體 將經LA Tag酶擴增后純化的MMP-2 pro cDNA基因PCR產物連接到pMD-18T載體上，經限制性內切酶Kpn I/Xho I雙酶切鑒定。分別切出一長約1.7 kb條帶和一長約2 692 bp條帶。電泳圖譜見圖2，上述酶切鑒定成功的質粒送上海生工生物技術有限公司進行測序，結果完全正確，未發現突變堿基。

M：DNA Marker；1：MMP-2 pro cDNA,下圖同圖1 PCR擴增MMP-2 pro cDNA

圖2 MMP-2 pro cDNA片段連接到T載體后Kpn I/Xho I雙酶切鑒定

2.3pGL3-MMP-2 pro cDNA載體構建 采用限制性內切酶Kpn I/Xho I雙酶切pMD-18T-MMP-2 pro cDNA，MMP-2 pro cDNA片段經電泳凝膠回收，將其克隆到pGL3的Kpn I/Xho I酶切位點之間。Kpn I/Xho I雙酶切后可得到約1.7 kb和4 818 bp的兩個條帶(見圖3)，說明連接成功。

2.4螢光素酶活性分析 以完整MMP-2啟動子的活性為100，各組啟動子活性比較結果顯示：加CoCl2誘導HIF-2α高表達的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α組啟動子活性為136±0.866，顯著高于pGL3-MMP-2 pro組(100±0.765,P<0.05)、陰性對照組(37±0.565，P<0.01)和空白對照組(21±0.365，P<0.01)，提示HIF-2α增強了MMP-2啟動子的轉錄活性。

圖3 重組pGL3-MMP-2 pro cDNA鑒定

3 討 論

低氧微環境是大多數實體瘤的重要特征，低氧微環境可通過調控多種基因表達而促進腫瘤的發生發展，盡管這些過程是由多種信號通路共同調控的〔5〕，其中HIFs在這一過程中發揮重要作用。HIFs是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異二聚體。目前發現的哺乳動物中有三種HIF-α亞基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，均可與HIF-β亞單位結合〔6〕。隨著載體構建、基因轉染技術、基因沉默實驗等多項精細實驗方法的使用及研究的不斷深入，近期有許多關于HIF這一調節系統的最新發現，研究發現HIF-2α的靶基因涉及能量代謝、兒茶酚胺合成、鐵代謝、骨髓造血、血管生長和血管收縮等方面〔7〕。HIF-2被激活后可作用于一系列的靶基因，這些靶基因的啟動子或增強子中均含有1個小于100 bp的缺氧反應元件(HRE)，其核心序列為5′-ACGTGCT-3′，是HIF-2與其結合的標識序列，HIF-2與靶基因HRE上HIF-2的結合位點結合成轉錄起始復合物從而啟動靶基因的轉錄〔8〕。MMP-2在惡性腫瘤的侵襲轉移及間質血管生成過程中起重要作用〔9〕。在人體內至少有三種調控機制可能影響MMP-2的活化，包括：轉錄水平調控，MMP-2蛋白的活化及金屬蛋白酶的組織抑制因子，其中基因轉錄水平調控失調是腫瘤相關基因表達異常的常見機制之一〔10〕。研究發現在胃癌中HIF-2α上調了MMP-2的表達并促進了胃癌的侵襲和轉移〔11〕。本文成功構建了人MMP-2啟動子螢光素酶報告基因，并在細胞內證明了HIF-2α能夠增強MMP-2啟動子的轉錄活性。

1Lotfi A，Mohammadi G，Saniee L，etal.Serum level of matrix metalloproteinase-2 and-9 in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and clinical significance 〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2015；16(15)：6749-51.

2Wang HX，Qin C，Han FY，etal.HIF-2α as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival 〔J〕.Genet Mol Res，2014；13(2)：2817-26.

3李 娜，王洪興，張 潔，等.siRNA干擾缺氧誘導因子-2α對乳腺癌細胞增殖能力的影響〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2014；30(1)：6-9.

4Bian J，Sun Y.Transcriptional activation by p53 of the human type Ⅳ collagenase (gelatinase A or matrix metalloproteinase 2) promoter 〔J〕.Mol Cell Biol，1997；17(11)：6330-8.

5Sandlund J，Ljungberg B，Wikstr?m P，etal.Hypoxia-inducible factor-2 alpha mRNA expression in human renal cell carcinoma 〔J〕.Acta Oncol，2009；48(6)：909-14.

6Fan Y，Li H，Ma X，etal.Prognostic significance of hypoxia-inducible factor expression in renal cell carcinoma：a PRISMA-compliant systematic review and meta-analysis 〔J〕.Medicine (Baltimore)，2015；94(38)：e1646.

7Shin DH，Dier U，Melendez JA，etal.Regulation of MMP-1 expression in response to hypoxia is dependent on the intracellular redox status of metastatic bladder cancer cells 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2015；1852(12)：2593-602.

8Amelio I，Melino G.The p53 family and the hypoxia-inducible factors (HIFs)：determinants of cancer progression 〔J〕.Trends Biochem Sci，2015；40(8)：425-34.

9Lotfi A，Mohammadi G，Saniee L，etal.Serum level of matrix metalloproteinase-2 and-9 in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and clinical significance〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2015；16(15)：674967-71.

10Wu Z，Zang S，Liu W，etal.Cryoplasty for canine iliac artery stenosis and its impact on expression of TIMP-2 and MMP-2 〔J〕.Vasc Endovasc Surg，2015；49(5-6)：135-41.

11Tong WW，Tong GH，Chen XX，etal.HIF2α is associated with poor prognosis and affects the expression levels of survivin and cyclin D1 in gastric carcinoma 〔J〕.Int J Oncol，2015；46(1)：233-42.

R73-37

A

1005-9202(2017)24-6041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.016

河南省自然科學基金面上項目(16230041220)；河南省高校青年骨干教師資助項目(2012GGJS-136)；新鄉醫學院聯合培育基金資助項目(2014QN113)；河南省教育廳高等學校重點科研項目(16A310002)；河南省衛生廳醫學科技攻關項目(201403133)

1 新鄉市中心醫院

李 娜(1977-)，女，博士，副教授，主要從事惡性腫瘤分子病理學研究。

〔2016-10-27修回〕

(編輯 曹夢園)