HTRA1在中老年人牙周膜組織中的表達及對細胞增殖的作用

陸林杰 盧 怡 (錦州醫科大學中國人民解放軍第306醫院研究生培養基地，北京 100101)

HTRA1在中老年人牙周膜組織中的表達及對細胞增殖的作用

陸林杰 盧 怡 (錦州醫科大學中國人民解放軍第306醫院研究生培養基地，北京 100101)

目的探討絲氨酸蛋白酶(HTRA)1在中老年人牙周膜組織中的表達及對細胞增殖的作用。方法收集該院口腔頜面外科50歲以上患者的患者前磨牙8顆和第三磨牙4顆，要求牙根結構完整，無明顯牙周組織炎癥。RT-PCR和免疫組化法分別檢測人牙周膜組織中HTRA1 mRNA和蛋白表達情況；組織塊法培養原代人牙周膜細胞，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2'5-二苯基四氮唑溴藍(MTT)法檢測增殖情況；慢病毒轉染使細胞中HTRA1過表達和基因沉默，以空載體為對照，使用細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)檢測HTRA1對人牙周膜細胞增殖的影響。結果RT-PCR顯示HTRA1 mRNA在牙周膜組織中呈陽性表達；免疫組化染色顯示，HTRA1在牙周組織中呈陽性表達，主要表達于牙周膜細胞和細胞外基質中。人牙周膜細胞經體外培養后生長曲線符合該細胞的生長特征。慢病毒轉染成功干預HTRA1基因表達后，在培養1、3、5、7、9 d時，過表達組牙周膜細胞增殖速度明顯低于過表達空載體對照組，基因沉默組牙周膜細胞增殖速度明顯高于基因沉默空載體對照組(P<0.05)。結論HTRA1 mRNA及蛋白均表達于中老年人牙周膜組織中，并對牙周膜細胞增殖起到明顯調節作用。

絲氨酸蛋白酶1；牙周膜；細胞增殖

隨著年齡的增長，牙周膜中膠原纖維增多，細胞成分減少，厚度變薄，易引發牙周病，是中老年人失牙的主要原因之一〔1〕。絲氨酸蛋白酶(HTRA)廣泛存在于人體多個組織中，參與細胞增殖、凋亡、炎性反應等生理和疾病過程，其中HTRA1是重要的礦化調節因子，與關節炎、血管鈣化等病理性礦化存在明顯關聯〔2〕。目前HTRA1在人牙周膜中的生物學作用尚未明確。相關研究發現，HTRA1在人牙周膜細胞成骨分化中起到重要調節作用〔3〕，本研究擬探討HTRA1在中老年人牙周膜組織中的表達及對牙周膜細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清(美國Sigma)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)細胞增殖試劑盒、cDNA合成試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)；兔抗人HTRA1多克隆抗體(上海領成生物科技有限公司)；細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)(北京利維寧生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與鑒定 收集錦州醫科大學中國人民解放軍第306醫院口腔頜面外科拔除的50歲以上患者的前磨牙4顆，牙根結構完整，無明顯牙周組織炎癥。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后刮取牙根部1/3的牙周膜組織，放入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃ CO2孵箱中培養。牙周膜細胞約90%匯合后進行傳代，每3 d換1次細胞培養液。免疫細胞化學染色法鑒定細胞來源，選4～6代細胞進行實驗。

1.2.2標本收集和蘇木素-伊紅(HE)染色 收集該院口腔頜面外科拔除的50歲以上第三磨牙4顆，無明顯牙周炎癥。沖洗后用4%多聚甲醛溶液固定48 h，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，常規脫水、透明、石蠟包埋，5 μm連續切片備用。取部分切片進行常規HE染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3RT-PCR檢測 收集與上述要求相同的4顆前磨牙，刮取牙根部1/3的牙周膜組織，研碎后用Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μl，常規反應條件下共進行40個循環，引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。電泳分析PCR擴增產物。

1.2.4免疫組化染色 取部分切片脫蠟后在3% H2O237℃下孵育45 min，PBS沖洗后血清封閉30 min，加兔抗人HTRA1多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對照；37℃孵育30 min后加二抗，37℃孵育20 min，沖洗后加辣根過氧化物酶(HRP)標記的工作液，二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5人牙周膜細胞增殖情況檢測 采用MTT法進行檢測，將第3代人牙周膜細胞按1×103個/孔的密度接種到96孔板，培養第1、3、5、7、9、11、14天時，每孔分別加入MTT溶液20 μl，終濃度為5 mg/ml，孵育4 h后終止反應，棄去上清后每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩20 min后放入酶標儀，在490 nm波長處讀取各孔的吸光度值，以培養第1天吸光度值為對照數據。

1.2.6慢病毒感染人牙周膜細胞 使用HTRA1過表達慢病毒載體和shHTRA1慢病毒載體感染人牙周膜細胞，成功得到HTRA1過表達人牙周膜細胞(過表達組)和基因沉默的人牙周膜細胞(基因沉默組)；用空載體慢病毒感染的人牙周膜細胞為空白對照組，分別為過表達空載體對照組(NC1組)和基因沉默空載體對照組(NC2組)；不加慢病毒的細胞為陰性對照組。觀察培養1、3、5、7、9 d時HTRA1基因對人牙周膜細胞增殖的影響。

1.2.7慢病毒感染后細胞增殖情況檢測 將過表達組和NC1組、基因沉默組和NC2組人牙周膜細胞用胰酶消化后按5×103個/孔的密度接種到96孔板，培養第1、3、5、7、9天時用PBS洗滌3次，按試劑盒說明100 μl/孔加入CCK8工作液，孵育4 h，在450 nm波長處讀取吸光度值。

1.3統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1HTRA1在牙周膜組織中的蛋白及mRNA表達 RT-PCR顯示，HTRA1 mRNA在牙周膜組織中呈陽性表達。免疫組化染色顯示，HTRA1在牙周膜組織中的牙周膜細胞、血管內皮細胞、基質中均呈陽性表達，主要表達于牙周膜細胞和細胞外基質中，見圖1。

2.2牙周膜細胞增殖情況 MTT法檢測顯示，牙周膜細胞培養1～3 d生長相對緩慢，第1、3天的吸光度值分別為：0.181±0.057、0.208±0.060；3 d后增殖速度明顯增加并持續到第9天，第5、7、9天吸光度值分別為0.428±0.093、0.581±0.072、0.814±0.052；9～14 d增殖速度明顯減緩并逐漸進入平臺期，第11、14天吸光度值分別為0.782±0.115、0.837±0.160，符合細胞生長潛伏期、對數生長期、平臺期3個階段。

2.3慢病毒感染牙周膜細胞情況 慢病毒感染96 h后觀察綠色熒光蛋白表達，確定轉染效率。熒光顯微鏡下可見NC1和NC2組均存在明顯的綠色熒光蛋白表達，而陰性對照組未見綠色熒光(見圖2)。說明慢病毒成功轉染牙周膜細胞。

圖1 HTRA1在牙周膜組織中的蛋白表達(×400)

2.4HTRA1基因對牙周膜細胞增殖的影響 培養1、3、5、7、9 d時過表達組牙周膜細胞增殖的吸光度值分別為：0.905±0.094、1.642±0.049、1.122±0.057、1.118±0.041、1.116±0.031；NC1組分別為：1.060±0.064、1.913±0.097、1.953±0.268、1.294±0.157、1.250±0.113；基因沉默組分別為：0.531±

0.055、0.984±0.067、1.637±0.113、2.355±0.183、2.566±0.197；NC2組分別為：0.418±0.026、0.820±0.034、1.178±0.073、1.624±0.082、1.823±0.091。過表達組牙周膜細胞增殖速度明顯低于NC1組，差異有統計學意義(P<0.05)；基因沉默組周膜細胞增殖速度明顯高于NC2組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 慢病毒感染牙周膜細胞96 h后熒光蛋白表達情況(×400)

3 討 論

人牙周膜成纖維細胞是牙周組織修復、再生的基礎，HTRA1在不同組織中的表達具有特異性，與多種病理生理過程有關。已有研究發現，人牙周膜細胞中存在HTRA1表達〔4〕，但其在人牙周膜組織中的生物學作用仍未明確。HTRA1存在于體內多個正常組織中〔5〕，本研究結果提示，HTRA1在人牙周膜組織中可能發揮生物學作用。進一步分析結果顯示，高表達HTRA1后可明顯抑制人牙周膜細胞增殖，基因沉默后可顯著促進牙周膜細胞增殖。相關研究顯示，HTRA1可明顯抑制多種細胞的增殖和遷移，當其低表達時可起到促進作用，如影響卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞、視網膜內皮細胞等〔6〕。本研究有研究顯示，HTRA1基因可正向促進人牙周膜細胞成骨分化〔5〕。因此推測HTRA1基因可通過抑制牙周膜細胞增殖來促進向成骨細胞分化，但確切機制仍需進一步研究。

1羅愛華,謝 紅,岳朝暉,等.中老年牙周病流行趨勢現狀及其相關危險因素〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(17):4334-5.

2Supan JI,Shimomachi M,Hasan M,etal.HtrA1 is induced by oxidative stress and enhances cell senescence through p38 MAPK pathway〔J〕.Exp Eye Res,2013;112(5):79-92.

3Li R,Zhang Q.HtrA1 may regulate the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells by TGF-β1〔J〕.J Mol Histol,2015;46(2):137-44.

4廖雪峰.鹽酸米諾環素軟膏聯合甲硝唑緩釋藥膜治療慢性牙周炎的療效觀察〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2014;15(2):229-32.

5Wang G,Dubovy SR,Kovach JL,etal.Variants at chromosome 10q26 locus and the expression of HTRA1 in the retina〔J〕.Exp Eye Res,2013;112:102-5.

6Mullany SA,Moslemi-Kebria M,Rattan R,etal.Expression and functional significance of HtrA1 loss in endometrial cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2011;17(3):427-36.

R781.4

A

1005-9202(2017)24-6031-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.012

北京市科委首都市民健康項目(No.Z151100003915091)

盧 怡(1971-)，女，碩士，副教授，副主任醫師，主要從事牙科學研究。

陸林杰(1985-)，男，碩士，醫師，主要從事牙科學研究。

〔2017-05-23修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)