紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響

郭天笑 劉 嵩 張 琳 劉冬雪 楊子龍 劉松熠 徐煒燁 趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院應(yīng)用心理學(xué)院，吉林 吉林 132013)

紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響

郭天笑 劉 嵩 張 琳 劉冬雪 楊子龍 劉松熠 徐煒燁 趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院應(yīng)用心理學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的探討紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響及可能機(jī)制。方法昆明種小鼠90只，分為正常對照組、缺氧對照組及紅景天苷組，每組30只，置FLY-6型低壓艙內(nèi)，以1 m/s速度上升至7 000 m，停留30 min，1 m/s下降至地面，停留30 min，再上升，循環(huán)往復(fù)，持續(xù)8 w制成慢性缺氧模型。紅景天苷組小鼠每天灌胃給予200 mg/kg紅景天苷。實驗結(jié)束后，水迷宮檢測各組學(xué)習(xí)記憶能力，Hoechst檢測海馬齒狀回細(xì)胞凋亡情況，免疫組化檢測海馬齒狀回Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對照組比較，缺氧對照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，海馬細(xì)胞凋亡明顯增加，Bcl-2表達(dá)明顯減少，Bax表達(dá)明顯增加(均P<0.05)；與缺氧對照組比較，紅景天苷組學(xué)習(xí)記憶能力明顯增加，海馬細(xì)胞凋亡明顯減少，Bcl-2表達(dá)明顯增加，Bax表達(dá)明顯減少(均P<0.01)。結(jié)論長期慢性缺氧可以導(dǎo)致小鼠海馬細(xì)胞凋亡，學(xué)習(xí)記憶功能下降；紅景天苷可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)，減少海馬細(xì)胞凋亡，從而改善慢性缺氧導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降。

慢性缺氧；學(xué)習(xí)記憶；凋亡

缺氧對人體的影響是多方面的，在急性嚴(yán)重的缺氧條件下，對腦認(rèn)知功能的影響主要為快速的血氧下降所致的認(rèn)知功能改變，而慢性缺氧主要表現(xiàn)為代償作用，但無論急性還是慢性缺氧，只要到一定的嚴(yán)重程度，都會導(dǎo)致不同程度與形式的認(rèn)知功能障礙〔1,2〕。反復(fù)慢性缺氧暴露，會導(dǎo)致智力、注意、協(xié)調(diào)及解決問題的能力明顯下降〔3,4〕。一些慢性缺血、缺氧性疾病均可導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)改變，特別是膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元凋亡是腦功能改變的共同因素，正是這些改變導(dǎo)致腦認(rèn)知功能改變〔5,6〕。紅景天苷是藏醫(yī)中重要的抗缺氧、抗疲勞藥物，在吉林等高寒山區(qū)亦有分布，紅景天苷中的許多提取成分都有抗缺氧功能。本文探討紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 昆明種小鼠90只，購于吉林大學(xué)動物實驗室，雌雄各半，平均體質(zhì)量(21.4±2.2)g，在本實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對照組、缺氧對照組和紅景天苷組，每組30只。

1.2藥品與試劑 紅景天苷(哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，紅景天苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.75%)；Hoechst、Bcl-2、Bax抗體購于碧云天生物有限公司，Morris水迷宮由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)LY-6低壓氧艙由成都風(fēng)雷科技責(zé)任有限公司生產(chǎn)。

1.3實驗方法 正常對照組小鼠在低壓艙旁飼養(yǎng)，缺氧對照組和紅景天苷組置于低壓艙中，以1 m/s上升至7 000 m，停留30 min后，以1 m/s下降至地面，停留30 min再上升，如此循環(huán)，連續(xù)8 w；紅景天苷組每天每公斤體重灌胃給予紅景天苷200 mg，其他組給予等量體積生理鹽水。實驗結(jié)束時，進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練時，每只小鼠在同一點入水2次，找到平臺后，休息30 s，進(jìn)行下一次訓(xùn)練，120 s內(nèi)找不到平臺，引導(dǎo)上平臺，休息30 s，進(jìn)行下一次訓(xùn)練，記錄小鼠逃避潛伏期。5 d后，進(jìn)行定位航行實驗，撤去平臺，分別記錄從4個象限入水，游泳60 s，記錄經(jīng)過有效區(qū)平均停留時間。

1.4免疫組化檢測海馬組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 每組取2只小鼠，乙醚麻醉，開胸，暴露心臟，剪開左心室插入灌注針頭至升主動脈，用止血鉗固定，快速灌注100～150 ml預(yù)冷的生理鹽水(4℃)，待右心耳鼓漲，呈球狀，剪開右心耳，血液沖洗干凈后，灌注4%多聚甲醛(4℃)500 ml。先快后慢，持續(xù)約2 h。 斷頭取小鼠腦組織，置入同濃度多聚甲醛溶液中浸泡固定10 h，常規(guī)石蠟包埋及組織切片，片厚5 μm。免疫組化觀察海馬組織Bcl-2、Bax的表達(dá)。

1.5Hoechst熒光檢測海馬細(xì)胞凋亡 用 Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改變 與正常對照組比較，缺氧對照組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，平均有效區(qū)停留時間減小(P<0.01)；紅景天苷組逃避潛伏期延長，但不顯著，平均有效區(qū)停留時間明顯減小(P<0.05)。與缺氧對照組比較，紅景天苷組逃避潛伏期有下降，但不顯著，平均有效區(qū)停留時間有延長(P<0.05)。見表1。

2.2各組海馬組織Bcl-2、Bax的表達(dá) 各組海馬齒狀回細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)見圖1，其中棕色顆粒為陽性染色顆粒，缺氧后顆粒量明顯減少，使用紅景天苷后，染色有所增加；Bax蛋白表達(dá)見圖2，缺氧后，染色明顯加深，紅景天苷干預(yù)后，染色變淺。各組平均光密度值(OD值)見表2。與正常對照組相比，缺氧對照組Bcl-2 OD值明顯降低(P<0.01)，紅景天苷組明顯高于缺氧對照組(P<0.05)，但明顯低于正常對照組(P<0.05)；缺氧對照組Bax明顯高于正常對照組(P<0.01)，紅景天苷組Bax明顯高于正常對照組(P<0.05)，但明顯低于缺氧對照組(P<0.05)。與正常對照組相比，缺氧對照組Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)，紅景天苷組明顯高于缺氧對照組(P<0.01)，但明顯低于正常對照組(P<0.01)。

2.3各組海馬組織細(xì)胞凋亡情況(Hoechst熒光染色法) 圖3可見，正常對照組染色淺，呈淡藍(lán)色，缺氧對照組細(xì)胞核顏色發(fā)白邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核染色體濃集，并伴有細(xì)胞核固縮和細(xì)胞核碎片增加的現(xiàn)象，為細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型特征。給予紅景天苷組顏色有所下降，上述凋亡現(xiàn)象減弱，漸呈淡藍(lán)色。

表1 各組小鼠逃避潛伏期與平均有效停留時間

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與缺氧對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

圖1 各組海馬齒狀回Bcl-2表達(dá)(DAB，×400)

圖2 各組海馬齒狀回Bax表達(dá)(DAB，×400)

組別Bcl?2BaxBcl?2/Bax正常對照組0542±00620386±00534)1496±0184缺氧對照組0361±00702)0460±00582)0795±01902)紅景天苷組0410±00571)3)0409±00571)3)1022±01692)4)

圖3 小鼠海馬齒狀回核熒光染色鏡下觀察(Hoechst染色法，×400)

3 討 論

慢性缺血缺氧性疾病在臨床多種疾病中都可出現(xiàn)，由于長期較強(qiáng)程度的缺氧，神經(jīng)細(xì)胞會由于能量代謝等變化誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞變性、凋亡甚至出現(xiàn)纖維纏結(jié)。細(xì)胞凋亡是組織結(jié)構(gòu)改建的步驟之一，為機(jī)體生長不可或缺的條件，同時細(xì)胞凋亡也為細(xì)胞受損后提供了一種比壞死更有效減弱損傷對機(jī)體作用的方式，是由損傷因素啟動的一系列細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)過程，也是一個主動耗能的過程，為細(xì)胞內(nèi)凋亡程序所控制。Bcl-2基因與凋亡的關(guān)系密切，對線粒體膜完整性具有保護(hù)作用，可能是此基因抗凋亡作用的主要機(jī)制。Bcl-2的表達(dá)水平可反映海馬細(xì)胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)針對缺血缺氧損傷的藥物可使機(jī)體細(xì)胞Bcl-2表達(dá)上升，細(xì)胞凋亡減少〔7,8〕。 本研究顯示缺氧后Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降，說明海馬細(xì)胞的凋亡與該變化有關(guān)，凋亡相關(guān)蛋白在慢性缺氧小鼠的海馬細(xì)胞凋亡中起到了重要的作用。缺氧后，細(xì)胞能量產(chǎn)生障礙，并引起中性蛋白酶活性的病理性增加，可使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)分解，細(xì)胞骨架破壞導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔9～13〕。研究表明紅景天苷具有抗缺氧的作用〔14,15〕。本實驗提示紅景天苷抑制缺氧后海馬細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是使Bcl-2的表達(dá)增加，Bax的表達(dá)下降，從而抑制細(xì)胞的凋亡，保護(hù)海馬細(xì)胞。

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R395;R285

A

1005-9202(2017)24-6029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.011

吉林省科技廳科技發(fā)展項目(No.20130101157JC)；吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項目(No.2010-255)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(No.2014-363)

趙行宇(1970-)，男，副教授，主要從事生理心理學(xué)研究。

郭天笑(1987-)，男，碩士，助教，主要從事思想政治教育、心理健康教育研究。

〔2016-03-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)