信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達及基因沉默對甲狀腺癌細胞的影響

尤鳴達 李巖冰 張春英 (河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000)

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達及基因沉默對甲狀腺癌細胞的影響

尤鳴達 李巖冰 張春英 (河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000)

目的觀察信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達及沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘毎挠绊憽７椒▽TC-133細胞分為siRNA STAT3組、陰性對照組和空白對照組，RT-PCR測定FTC-133細胞STAT3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA的表達，Western印跡測定甲狀腺癌FTC-133細胞STAT3蛋白的表達，MTT法測定甲狀腺癌FTC-133細胞的生長，Transwell法檢測FTC-133細胞的遷移能力。結(jié)果老年甲狀腺癌組織中STAT3陽性率高于癌旁組織(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細胞中STAT3蛋白的表達量低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細胞中STAT3、MMP2、MMP9 mRNA的表達量低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率均明顯高于陰性對照組(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細胞中穿膜細胞數(shù)低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。結(jié)論老年甲狀腺癌組織中STAT3呈高表達，沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘毎甑脑鲋澈颓忠u能力有抑制作用。

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3；甲狀腺癌；基因沉默

高分化的甲狀腺癌多數(shù)能夠通過手術(shù)治療、碘131內(nèi)放射治療等取得比較好的效果，但部分患者出現(xiàn)失分化，其轉(zhuǎn)移灶的攝碘能力喪失或者降低。失分化的甲狀腺癌細胞轉(zhuǎn)移速度比較快，侵襲力比較強，是甲狀腺癌預(yù)后的重要影響因素。因低分化或者失分化的甲狀腺癌不能進行常規(guī)的聯(lián)合治療，新興的生物治療對低分化或者失分化的甲狀腺癌可能具有重要意義〔1，2〕。腫瘤的發(fā)生和多種因素有關(guān)，抑癌基因、癌基因、凋亡相關(guān)基因、細胞周期調(diào)控因子、血管生長因子等都和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，甲狀腺癌基因領(lǐng)域的研究有酪氨酸激酶受體基因的重排、BRAF基因突變、Ras基因點突變等〔3，4〕。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)與多種腫瘤關(guān)系密切〔5，6〕，與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展也有一定關(guān)系，在甲狀腺癌組織中呈高表達〔7～9〕。本文對老年甲狀腺癌組織中STAT3的表達情況進行研究，并觀察基因沉默STAT3對甲狀腺癌細胞增殖及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇唐山工人醫(yī)院2014年6月至2016年6月老年甲狀腺乳頭狀癌組織40例及癌旁組織40例，女29例，男11例；年齡(67.23±6.32)歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期5例，Ⅲ期14例；40例患者均經(jīng)病理證實為甲狀腺癌，均為甲狀腺首次手術(shù)患者，手術(shù)前未進行放化療及免疫治療。

1.2主要試劑 甲狀腺癌FTC-133細胞株(上海生命科學(xué)研究院)，兔抗人STAT3多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，RT-PCR試劑盒、MTT試劑盒、Transwell小室(美國Corning公司)等。

1.3方法

1.3.1老年甲狀腺癌及癌旁組織中STAT3表達 取甲狀腺癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本切成厚5 μm切片，采用免疫組化法測定STAT3的表達情況，一抗為兔抗人STAT3多克隆抗體，陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為STAT3陽性細胞。

1.3.2FTC-133細胞分組及轉(zhuǎn)染 將生長良好的FTC-133細胞分為siRNA STAT3組、陰性對照組和空白對照組，接種到24孔板中培養(yǎng)至細胞達85%以上融合時，加入siRNA/lipofectamin復(fù)合物，siRNA STAT3組轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA/lipofectamin復(fù)合物，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA/lipofectamin復(fù)合物，空白對照組未進行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h收集細胞。

1.3.3FTC-133細胞STAT3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA檢測 采用RT-PCR法測定目的基因和內(nèi)參基因β-actin的積分光密度值，目的基因的相對表達量=目的基因積分光密度值/β-actin的積分光密度值，實驗重復(fù)7次，取平均值。

1.3.4FTC-133細胞STAT3蛋白檢測 采用Western印跡檢測FTC-133細胞STAT3蛋白表達量，STAT3蛋白的相對表達量=STAT3光密度值/β-actin的光密度值，實驗重復(fù)8次，取平均值。

1.3.5FTC-133細胞增殖檢測 采用MTT法檢測FTC-133細胞的增殖，酶標(biāo)儀測定550 nm波長處光密度值，計算細胞抑制率，細胞抑制率=(空白對照組的光密度值-實驗組的光密度值)/空白對照組的光密度值。

1.3.6FTC-133細胞遷移能力檢測 采用Transwell法檢測各組細胞的遷移能力，取7個高倍視野計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每組7個復(fù)孔，取平均值作為穿膜細胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，率的比較采用χ2檢驗，多組均數(shù)間比較采用方差分析，組內(nèi)均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1STAT3在老年甲狀腺癌及癌旁組織中的表達 在老年甲狀腺癌細胞中，STAT3陽性產(chǎn)物主要定位在細胞質(zhì)中，甲狀腺癌組織中STAT3陽性率為72.5%，明顯高于癌旁組織中STAT3陽性率7.5%(χ2=35.208，P<0.05)。

2.2甲狀腺癌FTC-133細胞中STAT3蛋白的表達情況 siRNA STAT3組FTC-133細胞中STAT3蛋白的表達量(0.214±0.034)低于陰性對照組(0.397±0.042)和空白對照組(0.409±0.043)(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3甲狀腺癌FTC-133細胞中STAT3 mRNA的表達情況 siRNA STAT3組甲狀腺癌FTC-133細胞中STAT3 mRNA的表達量(0.112±0.022)低于陰性對照組(0.188±0.079)和空白對照組(0.205±0.043)(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4siRNA STAT3對甲狀腺癌FTC-133細胞生長的影響 siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率分別為(15.55±1.12)%、(59.92±6.88)%、(54.46±7.89)%，陰性對照組分別為(3.43±0.77)%、(12.08±3.35)%、(8.15±1.56)%；siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率均明顯高于陰性對照組(P<0.05)。

2.5siRNA STAT3對甲狀腺癌FTC-133細胞侵襲力的影響 siRNA STAT3組FTC-133細胞中穿膜細胞數(shù)(114.8±16.5)低于陰性對照組(156.9±6.7)和空白對照組(166.7±11.4)(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6siRNA STAT3對甲狀腺癌FTC-133細胞MMP2、MMP9 mRNA的影響 siRNA STAT3組FTC-133細胞MMP2、MMP9 mRNA水平低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組MMP2、MMP9 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 siRNA STAT3對FTC-133細胞MMP2、MMP9 mRNA的影響

與siRNA STAT3組比較：1)P<0.05

3 討 論

STAT3是STATs家族成員之一，在維持胚胎干細胞多能性中發(fā)揮重要作用。STAT3基因的過度激活或者過度表達能夠抵抗細胞凋亡，促進細胞無限生長，促使細胞發(fā)生癌變，過度激活的STAT3能夠進入細胞核，與靶基因DNA特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)MMP2、MMP9、cMyc等基因的表達，參與腫瘤細胞生長存活的調(diào)控。鐘寶元等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中STAT3陽性表達率增加；STAT3與結(jié)直腸癌的浸潤深度、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)；STAT3可能通過抑制E-cadherin促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)STAT3和甲狀腺癌的關(guān)系也比較密切〔11，12〕，黃雋等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)STAT3在甲狀腺癌組織中的表達增加，與甲狀腺癌組織分化、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；汪永旭等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)STAT3在甲狀腺癌組織中表達增加，和甲狀腺癌患者的年齡、包膜侵犯、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究結(jié)果也表明，STAT3和老年甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

RNA干擾技術(shù)是一種高效、快捷、經(jīng)濟的特異基因表達抑制技術(shù)，在基因表達調(diào)控的研究中被廣泛應(yīng)用，在惡性腫瘤的研究中也被廣泛應(yīng)用。本文采用RNA干擾技術(shù)沉默STAT3基因，發(fā)現(xiàn)RNA干擾技術(shù)可以有效抑制甲狀腺癌細胞中STAT3基因的過度表達，對甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲能力有一定抑制作用，能夠降低甲狀腺癌細胞中MMP2 和MMP9的表達。STAT3有希望成為甲狀腺癌基因治療的靶點。MMP2 和MMP9能夠增強腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)和基底膜的降解能力，改變細胞和細胞外基質(zhì)以及細胞和細胞之間的黏附能力，促進腫瘤內(nèi)新生血管的形成和內(nèi)皮細胞的遷移。沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘毎忠u力的抑制作用可能與其抑制MMP2 和MMP9的表達有關(guān)。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.005

尤鳴達(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事頭頸外科腫瘤方面研究。

〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)