乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌快速檢測的新體系

董彬+封麗霞+馮曉+王紅坤+李春梅

摘 要：食源性致病菌污染是乳制品安全問題的重要隱患之一，乳品中常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌等。目前，乳品中致病菌的檢測以培養法為主，但此類方法操作較為繁瑣，且耗時長，不能滿足檢測的時效需求。本文探索了熒光定量PCR技術在快速檢測乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的應用，并進行了大量的驗證試驗和實際檢測，形成了乳品中致病菌快速檢測的新體系。該體系可以在24h內完成金黃色葡萄菌和沙門氏菌的增菌與檢測，縮短了整體檢測時間，降低了檢測成本，為進一步改良乳品中致病菌快速檢測提供了參考數據。

關鍵詞：乳品 金黃色葡萄菌 沙門氏菌 熒光定量PCR 檢測

在食品安全問題日益多元化的今天，在食品中占特殊地位的乳及乳制品的安全性一直是社會和科學研究關注的焦點。乳制品營養豐富、搭配均衡，是一種經濟實惠的優質蛋白。我國是乳制品消費大國，也是世界第三大乳制品生產國。國家統計局數據顯示，[1]我國城鎮居民家庭鮮奶人均購買量由1996年的4.6kg上升到2006年的18.3kg，雖從2007年開始有所下降，但一直維持在14kg左右。然而，近年來頻繁發生的乳與乳制品質量安全事件引起了人們對乳制品安全的普遍關注。乳品極易遭受致病菌污染，常見的污染乳制品的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌等，其進入人體后會造成腹瀉、嘔吐、急性腸胃炎等病癥，嚴重時會危及生命。其中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是乳品檢測最普遍的項目。

金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛生問題，乳品尤其是原料乳極易受到金黃色葡萄球菌的污染。2009年歐洲食品安全局報道了5550例食物中毒事件，導致49000人患病、46人死亡，其中293例由金黃色葡萄球菌感染引起，由此可見金黃色葡萄球菌的危害極大。是歐洲最常見的4種引發食物中毒的病原菌之一[2]，生乳及乳制品污染中比較常見的另一種食源性致病菌是沙門氏菌（Salmonella spp.），受其感染的人和動物會出現傷寒、副傷寒等病癥，沙門氏菌一旦進入血液組織，則會導致系統性炎癥，甚至死亡。1994年美國暴發了由沙門氏菌導致的冰淇淋污染，導致約22400人患病[3]。

一個中等規模的乳品工廠，一天生產的不同類產品至少有上百個批次，加工過程中的原料、過程品、終產品、生產環境都需要檢測金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。GB 4789.1-2016規定同一批次產品需采集5個樣品進行檢測，故工廠的檢測量每天高達幾百個。根據GB 4789.4-2016和GB 4789.10-2016，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的定性判定至少需要3d，該方法操作較繁瑣、耗時長，不能滿足檢測的時效需求。由于低溫奶保質期較短，我國正在推動的國家優質乳工程，在對產品要求提高的同時也對檢測技術提出了新的挑戰。

本文提出的創新檢測體系優化了樣品前處理過程，并引入了熒光定量PCR分子檢測技術，可以在24h內完成金黃色葡萄菌和沙門氏菌的增菌和檢測。在進行了大量驗證試驗和實際檢測后，結果表明此檢測體系穩定性好，準確性高，縮短了整體檢測時間，并降低了檢測成本，為乳品致病菌檢測技術的創新發展提供了研究基礎。

1 實驗思路

常見致病菌qPCR的檢測限一般在103CFU/mL以下[4～6]，而增菌后濃度一般可達105CFU/mL以上，增菌后多個樣本增菌液混合提取核酸處理檢測相當于稀釋多倍（5個樣本增菌液混合相當于稀釋5倍），一般會高于檢測限，從理論上來講，采用五合一PCR檢測能夠滿足國標方法檢測的需求。

2 實驗材料

2.1 樣本

樣品取自光明乳業華東中心工廠生產線，主要為發酵乳（包括風味發酵乳、果味發酵乳、暢優發酵乳、健能發酵乳、大果粒發酵乳和莫斯利安發酵乳）和部分鮮奶制品（包括無乳糖牛奶、優倍牛奶、純牛奶與致優全鮮乳）。

2.2 菌株

金黃色葡萄球菌陽性菌株：ATCC27217；沙門氏菌陽性菌株：CMCC50333。

2.3 主要試劑

金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）LR70501、沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）LR70601，購自北京良潤生物科技有限公司。

2.4 主要儀器

實時熒光PCR儀：雅睿MA-6000P；恒溫培養箱、離心機（2mL、5mL、7mL）、掌式離心機（0.2mL 8聯管）、金屬浴、渦旋混合器、移液器（10μL、100μL、1000μL）及吸頭、離心管（2mL、5mL、7mL）、PCR反應管（0.2mL）等。

3 實驗方法

3.1 驗證實驗

同一樣品的5次采樣為1組，其中取1～5次進行金黃色葡萄球菌/沙門氏菌添加（101 CFU），使用國標增菌培養基增菌后，分別取1mL混合后進行基因組提取，5次采樣的增菌培養基按照國標方法繼續進行后續鑒定，并記錄鑒定結果（共30組，只記錄組檢測結果）。

3.2 樣本實驗

在工廠進行實際樣本（發酵乳及部分其他鮮奶制品）的檢測，采用五合一PCR方法（同時以國標方法來做對比）記錄每組檢測結果，共1596組發酵乳、912組鮮奶制品。在前兩周的檢測中，每天從樣品中取兩組，從中各取一份樣品進行陽性添加并記錄檢測結果（共30組）。

4 結果與分析

4.1 驗證結果分析

金黃色葡萄球菌五合一PCR驗證實驗結果表明，五合一 PCR檢測與普通國標法檢測結果沒有顯著性差異，不會出現漏檢現象，如表1。

注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽性添加；*2表示1個樣品的5次采樣按照國標法檢測，有一次為陽性該樣品即為陽性；*3表示1個樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進行基因組提取檢測，結果即為樣品結果。

沙門氏菌五合一PCR驗證實驗結果表明，該檢測與普通國標法檢測結果沒有顯著性差異，不會出現漏檢現象，如表2。

注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽性添加；*2表示1個樣品的5次采樣按照國標法檢測，有一次為陽性該樣品即為陽性；*3表示1個樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進行基因組提取檢測，結果即為樣品結果。

4.2 樣本實驗結果分析

在1596組發酵乳及912組鮮奶制品的金黃色葡萄球菌檢測實驗中，五合一PCR檢測與國標法檢測結果沒有顯著性差異（國標法發酵乳金黃色葡萄球菌檢測有55組疑似陽性，但后續驗證結果為金黃色葡萄球菌陰性；共30組樣品的陽性添加用兩種方法檢測都為陽性），如表3所示。

在1596組發酵乳及912組鮮奶制品的沙門氏菌檢測實驗中，五合一PCR檢測與國標法檢測結果沒有顯著性差異（國標法沙門氏菌檢測有38組疑似陽性，但后續驗證結果為沙門氏菌陰性；共30組樣品的陽性添加用兩種方法檢測都為陽性），如表4所示。

5 結論與展望

5.1 結論

本文探索了一種乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌快速檢測體系，采用Real-Time PCR方法，對一組樣本5次采樣的前增菌液混合后進行基因組提取，使用金黃色葡萄球菌和沙門氏菌核酸檢測試劑盒進行檢測，極大的縮短了檢測時間，減小了工作強度。

經過驗證實驗以及實際樣品加標實驗，五合一PCR檢測與常規國標檢測結果并沒有顯著差異，不會造成漏檢。

通過對1596組發酵乳及912組鮮奶制品的應用實驗，在檢測發酵乳與鮮奶制品時，五合一PCR檢測與常規國標檢測相比耗時更少，準確度更好，工作強度更低。

5.2 展望

目前，有研究人員探索了食品中多種致病菌的同步增菌[7]技術，未來有希望由一種培養基來實現多種致病菌的同步增菌，而多重PCR也可實現多種致病菌的同時檢測，技術的發展將會使致病菌的檢測更加便捷。

近年來，國際標準化組織（ISO）已將PCR方法制定為檢測食源性致病菌的標準化方法[8]。不久的將來，熒光定量PCR有望在沙門氏菌及其他致病菌快速檢測上實現方法的標準化。建議食品檢驗方法應剝離于安全標準之外（即非強制性），給予檢測者選擇使用快速檢驗方法的合理空間。

隨著乳制品質量要求和營養要求的不斷提高，對相應的檢測技術也提出了更高的要求。隨著科技的不斷發展，乳制品中致病菌的檢測靈敏度、特異性、準確性、便捷性和及時性等方面都將得到不斷的發展和改善。

參考文獻：

[1] 張亞紅，王娉.預測微生物學在乳及乳制品中的應用[J].檢驗檢疫學刊，2015，25（6）：62-65.

[2] European Food Safety Authority.The European Union summary report on trends and sources of Zoonoses，Zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009[J].EFSA Journal，2011，9（3）：2090.

[3] 鄢雷娜等.乳制品中常見食源性致病菌檢測技術的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（1）：137-141.

[4] 佘容等.TaqMan熒光定量PCR在飼料沙門氏菌檢測中的應用評估[J].中國預防獸醫學報，2015，37（12）.

[5] 蘇裕心等.熒光定量PCR快速檢測金黃色葡萄球菌方法的建立[J].軍事醫學科學院院刊，2010，34（1）.

[6] 張馳等.食品中3種致病菌的Taqman多重熒光定量PCR檢測[J].食品研究與開發，2011，32（4）.

[7] 張巧艷等.乳制品常見致病菌選擇性共增菌技術研究[J].中國乳品工業，2011，39（5）.

[8] Malorny B，Made D，Teufel P，et al. Multicenter validation study of two blockcycler-and one capillarybased real-time PCR methods for the detection of Salmonella in milk powder[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，117：211-218.