云南榅桲的薄層培養再生體系建立和多倍體誘導

房 晨，劉鳳霞，王志剛，楊成泉，徐凌飛(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

云南榅桲的薄層培養再生體系建立和多倍體誘導

房 晨，劉鳳霞，王志剛，楊成泉，徐凌飛
(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

旨在建立云南榅桲的薄層培養再生體系，并以此為基礎進行云南榅桲的多倍體誘導。以云南榅桲莖段薄層為外植體，系統研究各種因素對莖段薄層再生不定芽的影響，以及不同質量濃度秋水仙素對云南榅桲莖段薄層不定芽再生率以及多倍體植株誘導的影響。結果表明，云南榅桲薄層再生不定芽的適宜培養基組合為MS+TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1，暗培養7 d，再生頻率最高為35.41%，平均再生芽數2.15。薄層再生苗在生根培養基1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1上已經生根。利用薄層再生結合秋水仙素處理誘導出云南榅桲多倍體，經流式細胞儀鑒定，確定獲得的多倍體為四倍體植株。

云南榅桲；薄層培養；秋水仙素；多倍體誘導

中國是世界梨生產大國，產量和面積多年來居世界第一[1]。梨矮化栽培具有樹體矮小、管理方便、早果、豐產、果品質量高等顯著優點，是現代果園的主要栽培模式。目前，可供生產栽培的梨矮化砧木資源非常稀少，榅桲是梨比較理想的矮化砧之一。嫁接在榅桲砧木上的梨栽培品種表現出樹體矮小、結果早、產量高和果實品質好等優點[2]，但榅桲對鹽堿地的適應性差，表現為生長不良，易出現葉片黃化現象[3]。

高等植物染色體進化的一個明顯特征就是體內的染色體加倍。多倍體植物在某些性狀上通常會比二倍體更加優良，比如其抗逆性和適應性較強。四倍體蒔菜的田間耐熱性遠高于二倍體[4]；多倍體西瓜、柑橘、刺槐的抗鹽性高于二倍體[5]。因此可以通過誘導多倍體的手段來改善云南榅桲的栽培適應性。

在多倍體育種中，為提高誘變效率，常常將誘變與離體再生相結合[6]，以縮短育種時間。薄層細胞培養是將外植體橫切成1 mm 厚的薄片進行培養，相比莖段、葉片，薄層作為再生培養的外植體具有來源廣泛、數量大，且可以直接經過器官發育途徑再生植株等優點。目前，榅桲組織培養研究主要集中在葉片、莖段、莖尖等外植體[7]，有關薄層細胞培養的相關報道較少，而用離體莖段薄層進行榅桲多倍體誘導的研究還未見報道。

本試驗對影響云南榅桲薄層不定芽的誘導因素進行系統研究；同時利用秋水仙素誘導云南榅桲的多倍體，建立云南榅桲的薄層培養再生體系及通過薄層培養再生誘導榅桲多倍體的技術體系，以期為云南榅桲倍性育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

以云南榅桲試管苗為材料，繼代培養基為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1與MS+6-BA 0.6 mg·L-1+ IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1交替使用，培養基pH調至5.8。

1.2 方 法

取云南榅桲無菌試管苗節間，用手術刀在無菌濾紙上橫切云南榅桲的莖段，注意避免切到腋芽，厚度約1 mm，然后將薄層細胞放置在無菌蒸餾水中待用或快速放置在不定芽誘導培養基中。

細胞分裂素對薄層再生的影響：將云南榅桲薄層接種于MS+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養基上，附加0.6 mg·L-1的IBA和不同質量濃度的細胞分裂素誘導再生不定芽。

生長素對薄層再生的影響：將云南榅桲薄層接種于MS+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養基上，附加1.5 mg·L-1的TDZ和不同質量濃度的生長素，誘導再生不定芽。

基本培養基對薄層再生的影響：將云南榅桲薄層接種于NN69、MS、1/2 MS 3種不同基本培養基上，每種培養基均附加TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1。

碳源對薄層再生的影響：將云南榅桲薄層接種于MS+TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養基上，再分別加入20、30和40 g·L-13個水平的碳源(蔗糖、山梨醇、葡萄糖)。

暗培養時間對薄層再生的影響：將云南榅桲薄層接種于MS+TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1+蔗糖30 mg·L-1的培養基上，分別進行0、3、7、14 d的暗培養。

培養條件：培養溫度(25±2) ℃，光周期16 h，光源為日光燈光源，光照度為2 000 lx。

通過莖段薄層再生誘導云南榅桲多倍體：取云南榅桲組培苗莖段，去葉片，放入已過濾滅菌的不同質量濃度的秋水仙素中。秋水仙素質量濃度分別為0、0.3、0.5和1 g·L-1。組培苗莖段在黑暗條件下震蕩培養24 h后，用無菌水洗凈殘留的秋水仙素，在無菌濾紙上用手術刀將云南榅桲莖段橫切成厚度1 mm左右的薄層，接種至薄層再生培養基中培養至不定梢再生。

多倍體的鑒定：在6 cm一次性細胞培養皿里加入1 mL改良獼猴桃解離液[8]，將50 mg云南榅桲葉片在解離液中一次性快速切碎，整個過程在冰面上進行。完成后用移液器上下吸打幾次，讓材料與解離液更充分地接觸。之后將細胞核提取液用500目尼龍網過濾，加入RNase和PI，孵育1 h后，用美國BD公司生產的FAC Scan流式細胞儀檢測[9]。以未經秋水仙素處理的云南榅桲組培苗葉片為對照，鑒定篩選株系的倍性。

1.3 數據分析

全部試驗完全隨機重復3次，每個處理6瓶，每瓶接種15個榅桲莖段薄層，60 d后統計數據。所有數據均用SPSS處理，采用Duncan’s新復極差法進行方差分析，數據表示形式為“平均數±標準誤”。

再生率=再生芽的薄層數/接種薄層數×100%

平均再生芽數=再生不定芽總數/再生不定芽的薄層數

存活率=處理后存活外植體數/處理總數×100%

2 結果與分析

2.1 云南榅桲薄層再生體系的建立

2.1.1 云南榅桲薄層不定芽再生過程 云南榅桲薄層接種5 d后開始腫脹膨大。在接種10 d后開始形成黃白色的愈傷組織(圖1-b)。14 d后有綠色的芽點從愈傷組織周圍長出。40 d左右有不定芽出現，不定芽有的呈單個分布，有的連成叢芽。55 d左右不定芽進入伸長階段，形成不定梢(圖1-c)。

2.1.2 細胞分裂素和生長素對云南榅桲薄層再生的影響 培養基中沒有添加TDZ和6-BA的處理均未發現不定芽再生(表1)，說明細胞分裂素對云南榅桲薄層再生是必需的。細胞分裂素TDZ和6-BA對云南榅桲薄層再生有不同的影響。隨著TDZ質量濃度的增加，再生頻率顯著提高，其中TDZ質量濃度1.5 mg·L-1的再生頻率最高，再生芽數最多，分別為24.62%和1.3。不同質量濃度6-BA對云南榅桲薄層再生影響也不同，當6-BA質量濃度過低或過高均沒有不定芽產生。6-BA質量濃度為2.5 mg·L-1時再生頻率最高，再生芽數最多。TDZ為1.5 mg·L-1時云南榅桲再生頻率顯著高于6-BA。另外，TDZ作為細胞分裂素的試驗組再生出的大多為叢芽，以6-BA作為細胞分裂素再生的大多為零星的單芽。因此，TDZ較6-BA更適宜云南榅桲的薄層再生。

培養基沒有添加生長素IBA、NAA和IAA的處理均有不定芽再生，但添加IBA、NAA和IAA處理的再生頻率和再生芽數均高于未添加的處理(表2)。說明生長素對云南榅桲薄層再生不是必需的，但有促進作用。IBA、NAA和IAA對云南榅桲薄層再生有不同的影響，隨著質量濃度的增加，NAA和IAA的再生頻率提高，IBA的再生頻率先上升后下降。其中0.4 mg·L-1IBA的再生頻率最高，再生芽數最多，分別為34.28% 和2.31。不同質量濃度NAA和IAA對云南榅桲薄層再生的影響也不同，0.6 mg·L-1IAA的再生頻率最高，但IAA質量濃度在0.4 mg·L-1和0.6 mg·L-1時無顯著差異；0.6 mg·L-1NAA的再生頻率最高，再生芽數最多，但不如IBA處理。綜上所述，IBA較NAA和IAA更適宜云南榅桲的薄層再生。

a.剛接種的榅桲莖段薄層 Thin cell layer excised from nodal segments；b.薄層接種10 d后開始形成黃白色的愈傷 Callus development from transverse thin cell layers；c.薄層40 d后形成不定芽 Adventitious shoots formation after 40 days；d.再生植株繼代 Shoots subculture micropropagation

圖1云南榅桲不定芽再生過程
Fig.1PlantregenerationfromtTCLsofYunnanquince

基于以上結果，選取TDZ作為誘導云南榅桲薄層再生的細胞分裂素，IBA作為誘導云南榅桲薄層再生的生長素，誘導云南榅桲再生不定芽。不同質量濃度TDZ和IBA組合處理對云南榅桲薄層再生有不同的影響(表3)。當培養基中TDZ質量濃度一定時，隨著IBA質量濃度的提高，云南榅桲再生頻率下降(TDZ質量濃度1.5 mg·L-1處理除外)，說明質量濃度過高的IBA不利于其再生。當培養基中IBA的質量濃度一定時，隨著TDZ質量濃度的提高，云南榅桲再生頻率提高，當TDZ質量濃度為1.5 mg·L-1時，再生頻率普遍高于其他處理。表明TDZ有助于提高云南榅桲薄層的再生頻率，其中TDZ質量濃度為1.5 mg·L-1，IBA質量濃度為0.4 mg·L-1時，再生頻率最高，平均再生芽數最多，分別為35.41%和2.15。

表1 細胞分裂素對云南榅桲薄層再生的影響Table 1 Effect of cytokinins on bud regeneration of tTCLs

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lower case letters mean significant difference(P<0.05)，the same below.

表2 生長素對云南榅桲薄層再生的影響Table 2 Effect of auxins on bud regeneration of tTCLs

表3 不同質量濃度的TDZ和IBA對云南榅桲薄層再生的影響Table 3 Effect of TDZ and IBA on bud regeneration of tTCLs

2.1.3 基本培養基對云南榅桲薄層再生的影響 將云南榅桲薄層接種于MS、1/2 MS、NN69的培養基，研究基本培養基對薄層再生的影響。結果表明，不同的基本培養基對云南榅桲薄層再生的影響不同(表4)。MS培養基的再生頻率最高，為35.41%，其次為NN69培養基； NN69培養基的再生芽數最高，為2.36，但是和MS相比無顯著差異。無論是再生頻率還是再生芽數，1/2 MS培養基的效果都不理想。因此，MS培養基較NN69、1/2MS培養基更適合云南榅桲的薄層再生。

表4 不同基本培養基對云南榅桲薄層再生的影響Table 4 Effect of different basic medium on bud regeneration of tTCLs

2.1.4 不同碳源對云南榅桲薄層再生的影響 以蔗糖、葡萄糖、山梨醇作為碳源研究不同種類碳源對云南榅桲薄層再生的影響。結果表明，不同種類的碳源對云南榅桲薄層再生有不同的影響(表5)。碳源的質量濃度對云南榅桲薄層再生影響也不同。同一種碳源隨著質量濃度的增加，再生頻率先上升后下降，說明碳源質量濃度過低或過高均不利于薄層再生。其中蔗糖質量濃度30 g·L-1時再生頻率最高，再生芽數最多，分別為35.41%和2.15。葡萄糖和山梨醇處理也都在質量濃度30 g·L-1時再生頻率最高，再生芽數最多，但都不如蔗糖處理組。因此，蔗糖較葡萄糖、山梨醇更適合云南榅桲的薄層再生。

表5 碳源對云南榅桲薄層再生的影響Table 5 Effect of different carbon sources on bud regeneration of tTCLs

2.1.5 不同暗培養時間對云南榅桲薄層再生的影響 將云南榅桲薄層進行0、3、7和14 d暗培養，研究暗培養時間對云南榅桲薄層再生的影響。結果表明，進行暗培養的處理再生頻率均顯著高于未進行暗培養的處理(表6)。說明云南榅桲薄層接種后進行一定時間的暗培養有助于云南榅桲薄層再生。其中進行7和14 d的暗培養效果最好，再生頻率最高，分別為35.41%和34.53%；再生芽數也最多，分別為2.15和2.06。7與14 d暗培養的再生頻率和平均再生芽數沒有顯著差異。因此，暗培養7或14 d都適合云南榅桲薄層再生。

表6 暗培養時間對云南榅桲薄層再生的影響Table 6 Effect of dark period on bud regeneration of tTCLs

2.1.6 云南榅桲再生植株不定芽的生長和生根 綜合以上結果，云南榅桲薄層再生不定芽誘導最佳培養基為MS+TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1，暗培養7 d。將誘導出的不定芽切下轉移到MS+6-BA 0.8 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養基上進行培養，不定芽發育成的不定梢生長正常，葉片伸展。當不定梢生長到2.5 cm左右時，接種至1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養基[10]，暗培養5 d后取出進行光照培養，獲得生根植株，生根率為85.6%，平均生根條數為2.66(圖2)。

圖2 云南榅桲薄層再生植株生根Fig.2 Rooting of regenerated plant from tTCLs

2.2 通過莖段薄層再生誘導云南榅桲多倍體

2.2.1 不同質量濃度的秋水仙素處理 通過秋水仙素處理結合薄層再生體系的方法誘導云南榅桲多倍體。用不同質量濃度的秋水仙素處理云南榅桲薄層發現，經秋水仙素處理后的薄層再生能力明顯下降，產生的愈傷組織偶爾還會出現紅色斑點。由表7可以看出，在處理時間一定的情況下，隨著秋水仙素質量濃度的升高，薄層外植體的存活率下降，不定梢再生對秋水仙素更加敏感，這可能是源于秋水仙素對植物材料的毒害作用。以莖段薄層作為外植體，外植體材料和秋水仙素接觸面積更大，所以毒害作用比較直接。以0.3 g·L-1秋水仙素處理的與對照相比，薄層的再生率無顯著差異；與0.5 g·L-1秋水仙素誘導的平均再生芽數無顯著差異。2株四倍體植株都是以0.3 g·L-1秋水仙素處理后的再生植株，而以0.5和1 g·L-1的處理均未獲得多倍體植株。

表7 不同質量濃度秋水仙素處理莖段薄層對多倍體誘導的影響Table 7 Effect of different mass concentrations of in vitro colchicine treatment on Yunnan quince tTCLs

2.2.2 云南榅桲多倍體鑒定 誘導的云南榅桲多倍體(圖3-d、圖3-f)和對照(圖3-b)相比，從外觀上看，在葉片大小、顏色深淺和莖段粗細上均無明顯的差異。對疑似多倍體的植株進行流式細胞儀測定結果表明，對照二倍體材料的峰頂點對應的熒光強度在200附近(圖3-a)，四倍體材料的峰頂點對應的熒光強度在400附近(圖3-c、圖3-e)，約為對照的2倍。四倍體流式圖中只有1個主峰，可以確定誘導的多倍體是純合的四倍體。

a.云南榅桲二倍體流式圖 Diploid Yunnan quince(Control)；b.二倍體榅桲 Diploid Yunnan quince(Control)；c、e.四倍體流式圖 Tetraploid Yunnan quince；d、f.四倍體榅桲 Tetraploid Yunnan quince

圖3云南榅桲的變異植株流式細胞儀測定結果
Fig.3FlowcytometricanalysisofsurvivingindividualsofshootsregeneratedfromtTCLsofYunnanquince

3 討 論

6-BA和TDZ是植物再生研究中使用頻率較高的細胞分裂素。趙竑博等[11]在對‘碭山酥’梨葉片再生的研究中發現TDZ誘導的愈傷組織與6-BA誘導的相比，表現出含水過多，產生不定芽玻璃化嚴重，因此6-BA要優于TDZ；吳中營等[12]在比較6-BA和TDZ對‘六月酥’梨葉片再生的影響時發現TDZ誘導的畸形芽很多，誘導效果并不比6-BA高；周佳紅等[13]在研究‘秋子梨’莖段薄層細胞培養采用的細胞分裂素也是6-BA；而Dolcet-Sanjuan等[14]對榅桲葉片再生的研究則表明TDZ在再生芽的誘導方面效果要遠好于6-BA。這些差異產生可能與材料的基因型和取材部位有關。本試驗通過比較6-BA、TDZ對云南榅桲薄層再生的影響，發現TDZ再生芽數整體上高于6-BA，經6-BA誘導出的愈傷組織較少，再生的芽大多為單芽，而以TDZ為細胞分裂素能誘導出大量的愈傷組織，再生的不定芽大多數為叢芽。因此，TDZ比6-BA更加適合云南榅桲的薄層再生。

生長素對云南榅桲薄層再生也有較大的影響。本研究單獨使用生長素再生出不定芽數量非常少，而單獨使用細胞分裂素卻可以誘導出相對較多的再生芽。本試驗單獨使用TDZ的處理誘導出不定芽，這與Dhi等[15]薄層培養相關試驗結果相似。在此基礎上，本研究發現同時加入生長素和細胞分裂素較單獨加入細胞分裂素的再生頻率更高，再生芽數更多。

不同基本培養基的差異主要是大量元素的配比不同，MS、NN69等培養基的區別主要是MS的無機鹽成分較高，無機鹽含量約為NN69的2倍；NN69與MS相比增添生物素和葉酸成分。對于薄層再生，前人使用的培養基為MS，但是在葉片再生中有用1/2MS、NN69培養基[11]。本研究通過比較MS、1/2 MS和NN69 3種基本培養基，發現NN69和MS作為基本培養基時，平均再生芽數顯著高于1/2 MS培養基，其中尤以NN69培養基再生芽數最高，但是和MS相比無顯著差異，且MS的再生頻率顯著高于NN69。綜合考慮MS培養基更加適合云南榅桲的薄層再生。

本研究結果表明，云南榅桲薄層再生頻率最高為35.41%。再生頻率跟一些再生效率高的試驗相比，不定芽的再生效率較低。可能與取材部位有關，云南榅桲葉片再生效率最高可達80%[16]。再生效率的差異還可和材料的基因型有關。另外，薄層外植體的厚度、生理狀態等亦是影響其再生的重要因素，這些將會是今后研究的重點之一。

多倍體育種常常伴隨著嵌合體的產生。如何從嵌合體中分離獲得純合的多倍體是個難點[17-18]。為了提高誘變效率，減少嵌合體的產生，一些研究者開始嘗試將誘變與離體再生相結合。劉慶忠等采用葉片再生的方法誘導蘋果多倍體，沒有發現嵌合體[19]；代勇等[20]通過愈傷組織再生的方法誘導青蒿多倍體，同樣沒有嵌合體產生；張計育等[21]采用葉片再生的方法誘導草莓多倍體，也沒有發現嵌合體。表明秋水仙素處理結合離體再生是一種有效解決多倍體誘導過程中產生嵌合體的方法。本試驗采用薄層再生的方法誘導云南榅桲多倍體也未發現有嵌合體產生，以莖段薄層作為外植體，因為它只由幾層細胞構成，若這幾層細胞全部或者大部分受秋水仙素影響使染色體加倍，那么它最終發育的再生植株就一定是純合的多倍體，很好地解決由于細胞發育的不同步性而產生嵌合體的問題。因此，結合薄層再生誘導外植體是一種有效的誘導云南榅桲多倍體方法。

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EstablishmentofRegenerationSystemfromTransverseCellThinLayersandPolyploidInductioninYunnanQuince(CydoniaoblongaMill)

FANG Chen, LIU Fengxia, WANG Zhigang, YANG Chengquan and XU Lingfei
(College of Horticulture, Northwest A&F University , Yangling Shaanxi 712100, China)

To establish the regeneration system from transverse cell thin layers of Yunnan quince and induct polyploid Yunnan quince, the factors that influence adventitious buds regeneration from transverse cell thin layer were examined systematically. In the induction of tetraploid, proliferating shoots of Yunnan quince were treated with different concentrations of colchicine for 24 h, then tTCLs sections were excised from the nodal segments and were transferred to shoot regeneration medium.Optimum response to direct adventitious shoot bud induction from tTCLs was observed on MS medium containing 1.5 mg·L-1TDZ,0.4 mg·L-1IBA,30 g·L-1sucrose, 7.0 g·L-1agar,and extra dark period of 7 days at the beginning of culture.The highest regeneration frequency of Yunnan quince was 35.41%,and the mean bud number per tTCLs was 2.15.The regenerated shoots were rooted on 1/2 MS+0.3 mg·L-1NAA+20 g·L-1sucrose+7 g·L-1agar.The ploidy level of the colchicine treated individuals was analyzed by flow cytometry.The results show that two of the shoots regenerated from tTCLs with excised from shoots of Yunnan quince treated with colchicie were tetraploid.

Yunnan quince；Transverse cell thin layer；Colchicine；Tetraploid

2017-05-15

2017-06-17

China Agriculture Research System(No.CARS-29-40)；Weinan Experimental Station Foundation of Northwest A&F University.

FANG Chen, male,master student. Research area: horticultural plant biotechnology.E-mail:fcgdjob@163.com

XU Lingfei,male,Ph.D,professor.Research area: fruit trees breeding and biotechnology.E-mail: lingfxu2013@sina.com

顧玉蘭ResponsibleeditorGUYulan)

日期：2017-12-21

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171221.1651.032.html

2017-05-15

2017-06-17

國家梨產業技術體系建設專項(CARS-29-40)；西北農林科技大學渭南試驗示范站建設專項。

房 晨，男，碩士研究生，研究方向為果樹學生物技術與育種。E-mail:fcgdjob@163.com

徐凌飛，男，博士，教授，研究方向為果樹種質資源與生物技術育種。E-mail: lingfxu2013@sina.com

S661.2

A

1004-1389(2017)12-1860-08