侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測(cè)

謝麗雪，張小艷，鄭姍，張立杰，李韜

?

侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測(cè)

謝麗雪，張小艷，鄭姍，張立杰，李韜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，福州 350013）

鑒定福建果園西番蓮上的夜來香花葉病毒（，TeMV），并建立用于該病毒特異性檢測(cè)的分子快速檢測(cè)方法，為該病毒的防治提供參考依據(jù)。采用血清學(xué)檢測(cè)、電鏡觀察、通用簡(jiǎn)并引物RT-PCR、特異性引物RT-PCR對(duì)福建西番蓮樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，并對(duì)陽性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序；根據(jù)已報(bào)道的夜來香花葉病毒基因序列和本研究的序列測(cè)定結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增TeMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因全長(zhǎng)的特異性引物，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立該病毒的特異性RT-PCR檢測(cè)方法；序列測(cè)定結(jié)果利用BLAST程序和DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)獲得的CP基因序列采用MrBayes軟件的貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一株表現(xiàn)有花葉、皺縮癥狀的西番蓮樣品與馬鈴薯Y病毒屬（）通用抗體反應(yīng)呈陽性；電鏡觀察結(jié)果表明，該株疑似帶毒樣品中含有大小約750 nm×12 nm的彎曲線狀病毒粒子；通用簡(jiǎn)并引物RT-PCR從該樣品中擴(kuò)增到一條與預(yù)期大小相符的目的片段，克隆、測(cè)序獲得長(zhǎng)度為680 bp的序列，該序列與已報(bào)道的TeMV核苷酸序列一致性最高（98.2%）。特異性引物擴(kuò)增獲得的CP基因序列全長(zhǎng)為816 bp（命名為BXGFJ-13分離物），與已報(bào)道的TeMV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分別為86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，13個(gè)TeMV分離物共形成3個(gè)類群，相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇，表現(xiàn)出很強(qiáng)的地理和寄主特異性。本研究獲得的BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）先以較高的后驗(yàn)概率聚為一個(gè)分支，再與泰國2個(gè)分離物（AM409188、AM409187）聚為第2類群（Group II），表明其在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與中國廣西分離物的親緣關(guān)系最近。利用特異性引物TeMV-CPf/TeMV-CPr建立的RT-PCR方法，具有良好的特異性，僅能從感染TeMV的西番蓮樣品上擴(kuò)增出目的片段，而從黃瓜花葉病毒（，CMV）、甜菜花葉病毒（，BtMV）、大豆花葉病毒（，SMV）、虎眼萬年青花葉病毒（，OrMV）、洋蔥黃矮病毒（，OYDV）、東亞西番蓮病毒（，EAPV）等其他病毒樣品及陰性對(duì)照上均未擴(kuò)增出目的片段。靈敏度測(cè)定結(jié)果顯示，該方法能從稀釋102倍的RNA上擴(kuò)增出目的片段。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）關(guān)于病毒不同成員的分類標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)、電鏡觀察結(jié)果，證實(shí)福建果園表現(xiàn)花葉、皺縮癥狀的西番蓮上攜帶有TeMV；建立的特異性RT-PCR方法能夠用于TeMV的快速檢測(cè)。

西番蓮；夜來香花葉病毒；分子鑒定；檢測(cè)

0 引言

【研究意義】西番蓮（）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（）多年生草質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)南美的巴西、阿根廷，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在中國主要分布于臺(tái)灣、廣東、福建、廣西、浙江、四川等地區(qū)。西番蓮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味獨(dú)特，果實(shí)含有130多種芳香類物質(zhì)，幾乎涵蓋了熱帶、亞熱帶大部分水果的香型，因此又稱百香果[1-4]。西番蓮作為一種高級(jí)天然飲料作物，在栽培生產(chǎn)過程中，常常受到病蟲害的危害，其中病毒病是西番蓮生產(chǎn)上的第2大病害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，在很多地區(qū)已成為限制西番蓮生產(chǎn)發(fā)展的重要因素[5-7]。近年來，隨著國內(nèi)消費(fèi)者對(duì)西番蓮需求的不斷增長(zhǎng)，中國西番蓮的種植面積逐漸增大，病毒病隨之發(fā)生、傳播和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)也越來越高。為預(yù)防與控制西番蓮病毒病，加強(qiáng)病毒的早期檢測(cè)，明確病毒發(fā)生的種類，對(duì)于及時(shí)制定有效的防治措施，保護(hù)西番蓮生產(chǎn)安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外報(bào)道能夠侵染西番蓮的病毒主要包括馬鈴薯Y病毒科（）馬鈴薯Y病毒屬（）的西番蓮木質(zhì)化病毒（，PWV）[8-9]、豇豆蚜傳花葉病毒（，CABMV）[10-12]、東亞西番蓮病毒（，EAPV）[13-14]、西番蓮果環(huán)斑病毒（，PFRSV）[15]、西番蓮Y病毒（，PaVY）[16-17]、西番蓮斑駁病毒（，PaMV）[18]、大豆花葉病毒（，SMV）[19]、馬來西亞西番蓮病毒（，MPV）[20]、夜來香花葉病毒（，TeMV）[21]，雀麥花葉病毒科（）黃瓜花葉病毒屬（）的黃瓜花葉病毒（，CMV）[22-23]，雙生病毒科（）菜豆金黃花葉病毒屬（）的大戟曲葉病毒（，ELCV）、廣東番木瓜曲葉病毒（，PaLCuGdV）、西番蓮扭葉病毒（，PLDV）[24-25]，蕪菁黃花葉病毒科（）蕪菁黃花葉病毒屬（）的西番蓮黃花葉病毒（，PFYMV）[26]，柑橘粗糙病毒屬（）的西番蓮綠斑病毒（，PFGSV）[27]，乙型線狀病毒科（）香石竹潛隱病毒屬（）的西番蓮潛隱病毒（，PLV）[28]，帚狀病毒科（）煙草花葉病毒屬（）的西番蓮花葉病毒（，MrMV）[29]和豇豆花葉病毒科（）線蟲傳多面體病毒屬（）的番茄環(huán)斑病毒（，ToRSV）等[30]。其中，夜來香花葉病毒（TeMV）是近年來西番蓮上新報(bào)道的一種病毒，基因組具有典型的結(jié)構(gòu)特征，正義ssRNA，全長(zhǎng)9 689 nts，編碼一個(gè)長(zhǎng)的聚合蛋白。TeMV的病毒粒體呈線狀，長(zhǎng)約750 nm，寬約12 nm。TeMV侵染寄主植物主要引起花葉癥狀，在越南夜來香、泰國西番蓮、印度尼西亞廣霍香上已有發(fā)生危害的報(bào)道，該病毒可通過機(jī)械接種傳播，但是否通過蚜蟲傳播尚未明確。由于西番蓮在生產(chǎn)上常采用扦插、嫁接育苗，因此TeMV可能通過上述途徑大面積或遠(yuǎn)距離傳播。鑒別寄主鑒定、電鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)、RT-PCR是植物病毒檢測(cè)診斷的常用方法。Chiemsombat等[21]通過電鏡觀察提純的病毒粒體形態(tài)、血清學(xué)和RT-PCR方法，檢測(cè)了泰國西番蓮上的TeMV，同時(shí)研制了用于該病毒快速檢測(cè)的免疫膠體金診斷試紙條，最低可檢測(cè)到稀釋640倍的感病西番蓮汁液；Ha等[31]在圓柱狀內(nèi)含體蛋白（cylindrical protein，CI）和輔助成分-蛋白酶（helper component- proteinase，HC-Pro）編碼區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)新的簡(jiǎn)并引物，從越南夜來香上檢測(cè)出TeMV，并測(cè)定了其全基因組序列。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于TeMV，國內(nèi)種植的西番蓮上尚未有該病毒發(fā)生的正式文獻(xiàn)研究報(bào)道，僅GenBank上有中國廣西分離物部分基因序列的記錄（KJ789129）。福建西番蓮種植園內(nèi)疑似帶毒樣品上是否攜帶有TeMV有待進(jìn)一步明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用血清學(xué)、電鏡觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)引起福建西番蓮花葉、皺縮癥狀的病原進(jìn)行鑒定，明確其具體種類，并建立該病毒的特異性分子快速檢測(cè)方法，為該病毒的檢測(cè)及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所完成。

1.1 材料

供試西番蓮樣品采自福建西番蓮種植園，共56份，保存于-80℃冰箱。供試毒源CMV、BtMV、SMV、OrMV、OYDV、EAPV等由筆者實(shí)驗(yàn)室保存。通用抗體檢測(cè)試劑盒購自Agdia公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin購自Promega公司；DNA聚合酶、pMD-18T載體購自TaKaRa公司；DNA Marker、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。裂解介質(zhì)管購自美國MP Biomedicals公司。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)

采用Indirect-ELISA方法，具體參照試劑盒說明書。試驗(yàn)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，3個(gè)重復(fù)。利用Infinite M200多功能酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm下的OD值，樣品OD405 nm/陰性對(duì)照OD405 nm＞2時(shí)，判定檢測(cè)結(jié)果為陽性。

1.3 電鏡觀察

采用2%磷鎢酸負(fù)染色，西番蓮樣品提取液吸附于銅網(wǎng)支持膜后置于H-7650透射電鏡下觀察病毒粒體形態(tài)。

1.4 總RNA提取

稱取0.1 g西番蓮葉片樣品放入2 mL裂解介質(zhì)管中，加入1 mL TrizoL試劑，在MP FastPrep?-24研磨機(jī)上研磨后靜置5 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，取上清；加入氯仿300 μL，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置15 min，4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用1 mL 75%冷乙醇洗滌后4℃下7 500 r/min離心3 min，棄上清；RNA沉淀干燥后，用30 μL經(jīng)DEPC（焦碳酸二乙酯）處理過的ddH2O溶解，-80℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

通用簡(jiǎn)并引物為正向引物L(fēng)egpotyF：5′-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3′，反向引物L(fēng)egpotyR：5′-AYYTGYTYMTCHCCATCCATC-3′[32]；特異性引物根據(jù)已報(bào)道的TeMV外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)，正向引物TeMV-CPf：5′-TCAAGTAAGGTGGATG ATGTT-3′，反向引物TeMV-CPr：5′-CTGCACAGAGC CAACCCCAA-3′，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6 RT-PCR

以提取的西番蓮葉片總RNA為模板（3 μL），加入隨機(jī)引物（10 μmol·L-1）1 μL、ddH2O 7 μL，72℃水浴10 min后迅速冰浴，再依次加入M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液（5×）5 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL、RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）1 μL，42℃1 h、72℃10 min合成cDNA。通用簡(jiǎn)并引物PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR mix 12.5 μL，LegpotyF（10 μmol·L-1）1 μL，LegpotyR（10 μmol·L-1）1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、45℃退火45 s、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。特異性引物PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR Buffer（10×）2.5 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、TeMV-CPf（10 μmol·L-1）1 μL、TeMV-CPr（10 μmol·L-1）1 μL，DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μl，ddH2O 13.8 μL，cDNA 2 μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠（含GelRed染料）電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.7 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序及序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收目的片段，連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，然后涂布含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)采用BLAST和DNAMAN軟件。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用MrBayes 3.26軟件[33]貝葉斯法（Bayesian inference，BI），通過ModelFinder[34]計(jì)算獲得最佳核苷酸替換模型為HKY+G4，并參照BIC標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置相關(guān)參數(shù)，共運(yùn)行200萬代，每隔100代抽樣1次，舍棄25%老化樣本后，根據(jù)剩余的樣本樹獲得50%多數(shù)原則一致樹（50% majority-rule consensus tree），樹各節(jié)點(diǎn)的置信度通過計(jì)算的后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）進(jìn)行評(píng)估。在重建BI樹過程中，以大豆花葉病毒分離物（FJ548849）為外群（outgroup）。

1.8 特異性引物RT-PCR的特異性、靈敏度測(cè)定

分別以CMV、BtMV、SMV、OrMV和EAPV毒源及感染TeMV的西番蓮葉片為樣品，同時(shí)以健康西番蓮葉片為陰性對(duì)照，利用引物對(duì)TeMV-CPf/ TeMV-CPr進(jìn)行RT-PCR，測(cè)定特異性。將從感染TeMV的西番蓮葉片中提取的總RNA，用健康西番蓮葉片提取的總RNA作10倍梯度稀釋，以引物對(duì)TeMV-CPf/TeMV-CPr進(jìn)行RT-PCR，測(cè)定靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)

采用Indirect-ELISA對(duì)疑似帶毒西番蓮樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一株表現(xiàn)有花葉、皺縮癥狀的樣品（編號(hào)為FJ-13，圖1）提取液與通用抗體呈陽性反應(yīng)，樣品OD405nm與陰性對(duì)照OD405nm的比值＞3，表明該樣品上可能含有病毒。

2.2 電鏡觀察

將ELISA檢測(cè)為陽性的西番蓮樣品（FJ-13）提取液進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，該樣品中含有大小約750 nm×12 nm的彎曲線狀病毒粒體，與已報(bào)道的典型病毒粒體的形態(tài)相似。

圖1 西番蓮樣品（FJ-13）花葉、皺縮癥狀

圖2 西番蓮樣品（FJ-13）病毒粒體的電鏡觀察

2.3 通用簡(jiǎn)并引物RT-PCR檢測(cè)

利用通用簡(jiǎn)并引物對(duì)西番蓮樣品FJ-13進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明，LegpotyF/LegpotyR 能從該樣品上擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的片段，而從陰性對(duì)照和空白對(duì)照中未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段（圖3）。將PCR目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序，共獲得680 nts的序列，與預(yù)期大小相符，包含核內(nèi)含體蛋白b（nuclear inclusion body ‘b’ protein，NIb）基因3′末端和CP基因5′末端部分序列。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與GenBank已報(bào)道的夜來香花葉病毒（TeMV）基因序列存在高度一致性，其中與中國廣西分離物（KJ789129）序列一致性最高，達(dá)98.2%，與越南分離物（DQ851493）序列一致性最低（79.9%）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，樣品FJ-13上可能攜帶有的TeMV。

2.4 特異性引物RT-PCR檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的TeMV特異性外殼蛋白引物TeMV- CPf/TeMV-CPr對(duì)西番蓮樣品FJ-13進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果從該樣品上獲得了大小約816 bp的目的片段（圖4），與預(yù)期大小一致。序列測(cè)定結(jié)果表明，目的片段大小完全相符，序列長(zhǎng)度為816 nts（GenBank登錄號(hào)為MG189584），為完整的CP基因序列，編碼272個(gè)氨基酸。該分離物（命名為BXGFJ-13）的核苷酸序列和氨基酸序列與中國廣西分離物（KJ789129）的一致性最高，分別為98.4%和97.8%；與越南分離物（DQ851493）的一致性最低，分別為86.2%和88.2%；與其他TeMV分離物核苷酸序列一致性在87.9%—92.1%，氨基酸序列一致性在87.9%—93.0%（表1）。此外，在BXGFJ-13 CP基因的氨基酸序列中，第8—10個(gè)氨基酸組成與病毒蚜傳相關(guān)的保守基序DAG（圖5）。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：樣品FJ13 Sample FJ13；2：陰性對(duì)照Negative control；3：空白對(duì)照Blank control。圖4同The same as Fig. 4

圖4 樣品FJ-13的特異性引物RT-PCR

2.5 BXGFJ-13分離物與其他分離物的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)TeMV的CP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，來自不同國家、地區(qū)的13個(gè)TeMV分離物共形成3個(gè)類群（圖6）。所有的印度尼西亞分離物以較高的后驗(yàn)概率聚為第1大類群（Group I），本研究獲得的BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）、兩個(gè)泰國分離物Pangda15（AM409188）和Pangda12（AM409187）組成第2大類群（Group II），其中BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）以較高的后驗(yàn)概率（PP=100%）先聚為一個(gè)分支，而后與泰國分離物（AM409188、AM409187）進(jìn)一步相聚成簇；越南分離物Hanoi（DQ851493）獨(dú)立一個(gè)分支，單獨(dú)形成第3大類群（Group III）。相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇，表現(xiàn)出很強(qiáng)的地理和寄主特異性。

圖5 BXGFJ-13分離物外殼蛋白基因的氨基酸序列與其他分離物的比對(duì)（DAG用黑線框標(biāo)注）

表1 BXGFJ-13分離物與TeMV其他病毒分離物外殼蛋白基因的核苷酸（nt）和氨基酸（aa）序列一致性

圖6 基于外殼蛋白基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 特異性引物RT-PCR的特異性、靈敏度測(cè)定

應(yīng)用建立的特異性引物RT-PCR方法分別對(duì)TeMV、CMV、BtMV、SMV、OrMV、OYDV、EAPV及健康西番蓮樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果僅從感染TeMV樣品上擴(kuò)增出目的片段，從其他病毒及健康西番蓮上均未擴(kuò)增出目的片段（圖7），表明該方法具有良好的特異性。靈敏度測(cè)定結(jié)果表明，建立的特異性引物RT-PCR具有較高的靈敏度，當(dāng)TeMV陽性樣品總RNA原液稀釋102倍時(shí)，仍能擴(kuò)增出清晰的特異性條帶，但進(jìn)一步稀釋103倍時(shí)，擴(kuò)增出的特異性條帶較淡（圖8）。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：TeMV樣品TeMV sample；2：CMV樣品CMV sample；3：BtMV樣品BtMV sample；4：SMV樣品SMV sample；5：OrMV樣品OrMV sample；6：OYDV樣品OYDV sample；7：EAPV樣品EAPV sample；8：陰性對(duì)照Negative control

3 討論

病毒是西番蓮上發(fā)生較為嚴(yán)重的一類病毒，對(duì)西番蓮的產(chǎn)量能夠造成較大的影響。其中PWV、CABMV和EAPV等病毒侵染西番蓮引起的木質(zhì)化病，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[35]。夜來香花葉病毒（TeMV）作為近年來西番蓮上新報(bào)道的病毒，目前僅在泰國西番蓮上有明確發(fā)生的研究報(bào)道[21]，其危害程度、傳播機(jī)制、發(fā)生規(guī)律等尚不清楚，為避免該病毒傳播、擴(kuò)散和流行后對(duì)西番蓮的生產(chǎn)造成重大影響，亟需加強(qiáng)對(duì)該病毒的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及控制。本研究采用血清學(xué)、電鏡觀察、RT-PCR及序列測(cè)定的方法對(duì)福建果園西番蓮上的疑似帶病樣品的毒源進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定，證實(shí)一株具有花葉、皺縮癥狀的樣品攜帶有TeMV。為實(shí)現(xiàn)對(duì)TeMV的準(zhǔn)確檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增該病毒CP基因全長(zhǎng)的特異性引物，建立了TeMV的特異性分子檢測(cè)方法，具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果獲得的CP基因完整編碼區(qū)序列可用于后續(xù)的病毒種類判定和系統(tǒng)發(fā)育分析。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：TeMV RNA（100）TeMV RNA (100)；2：101倍稀釋101 times dilution；3：102倍稀釋102 times dilution；4：103倍稀釋103 times dilution；5：104倍稀釋104 times dilution；6：105倍稀釋105 times dilution；7：106倍稀釋106 times dilution；8：陰性對(duì)照Negative control

由于西番蓮病毒病的防治十分困難，因此選用無毒的健康種苗是一項(xiàng)有效措施，而病毒快速檢測(cè)技術(shù)則是篩選無毒種苗的關(guān)鍵。近年來，已報(bào)道的TeMV鑒定方法主要包括電鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)。利用電鏡能夠直接觀察病毒粒體形態(tài)，但無法判定具體病毒種類，僅能作為TeMV的輔助鑒定手段。血清學(xué)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但TeMV尚未有商品化的ELISA試劑盒，大多采用通用抗體試劑盒來進(jìn)行初篩。電鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果只能用于TeMV的初步診斷，該病毒的確認(rèn)須經(jīng)RT-PCR和序列分析結(jié)果。利用通用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行RT-PCR，然后對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果判斷病毒種類，該方法已被用于該屬多種病毒的檢測(cè)。Zhang等[36]利用通用簡(jiǎn)并引物檢測(cè)方法，在中國野生茄子上首次鑒定出野生花葉，WTMV）；Ohshima等[37]以采集的日本水仙為材料，應(yīng)用通用簡(jiǎn)并引物檢測(cè)方法檢出水仙遲季黃化病毒（，NLSYV）、水仙黃條病毒（，NYSV）、水仙退化病毒（，NDV）和（CyEVA）等多種病毒復(fù)合侵染水仙。目前，通用簡(jiǎn)并引物用于TeMV檢測(cè)的研究報(bào)道較少。Noveriza等[38]利用通用簡(jiǎn)并引物對(duì)印度尼西亞廣藿香進(jìn)行了TeMV檢測(cè)與鑒定。通用簡(jiǎn)并引物檢測(cè)具有一定的廣譜性，除可以檢測(cè)TeMV外，同時(shí)還可檢測(cè)到西番蓮上可能感染的其他病毒種類，有助于發(fā)現(xiàn)復(fù)合侵染。但與特異性引物不同，通用簡(jiǎn)并引物的RT-PCR產(chǎn)物必須要進(jìn)一步克隆測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果來鑒定病毒種類，并且為防止漏篩，應(yīng)盡可能測(cè)定多個(gè)克隆子，相對(duì)檢測(cè)成本較高。本研究建立的特異性RT-PCR方法，專用于TeMV的檢測(cè)，特異性強(qiáng)、靈敏度高，適合于該病毒的針對(duì)性檢測(cè)。因此，在西番蓮病毒檢測(cè)中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同，分別選用不同的引物來進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，在僅檢測(cè)TeMV時(shí)采用特異性引物，若同時(shí)檢測(cè)是否有多個(gè)病毒復(fù)合侵染則采用通用簡(jiǎn)并引物。

按照國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）關(guān)于病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)，即CP基因氨基酸序列一致性約低于80%；CP基因或整個(gè)基因組的核苷酸序列一致性低于76%[39]。本研究測(cè)定的BXGFJ-13分離物CP基因氨基酸、核苷酸序列與已報(bào)道的TeMV分離物一致性最高分別為97.8%、98.4%，顯著高于80%、76%標(biāo)準(zhǔn)，與病毒種的劃分標(biāo)準(zhǔn)相符，確認(rèn)BXGFJ-13為TeMV的一個(gè)分離物。Chiemsombat等[21]研究報(bào)道，西番蓮上的2個(gè)TeMV分離物（AM409188、AM409187）的CP基因氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)與病毒蚜傳相關(guān)的保守基序DAG，DAG被DTG取代，即第9位的氨基酸由A突變?yōu)門。本研究從西番蓮上獲得的BXGFJ-13分離物氨基酸序列中存在DAG，說明BXGFJ-13可能通過蚜蟲傳播，但在果園內(nèi)蟲害調(diào)查時(shí)未發(fā)現(xiàn)蚜蟲，推測(cè)這可能受蟲害調(diào)查次數(shù)限制影響未及時(shí)發(fā)現(xiàn)蚜蟲，除此之外，也有可能是不通過蚜傳而僅是帶毒苗的扦插或嫁接繁殖引起，BXGFJ-13是否可以蚜傳及其傳播機(jī)制有待進(jìn)一步研究。由于TeMV可能單獨(dú)或與其他病毒復(fù)合侵染西番蓮，引起嚴(yán)重的木質(zhì)化病，若證實(shí)能通過蚜蟲傳播，則極易通過蚜蟲在西番蓮種植區(qū)大面積傳播。因此，為防范該病毒暴發(fā)流行，應(yīng)加強(qiáng)西番蓮引種苗的檢測(cè)，及時(shí)剔除帶毒苗，同時(shí)在西番蓮生產(chǎn)期間注意防治蚜蟲。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示國家（或地區(qū)）、寄主來源相同的TeMV分離物優(yōu)先相聚成簇，表現(xiàn)出很強(qiáng)的地區(qū)和寄主特異性，究其原因可能是該病毒的適應(yīng)性進(jìn)化同時(shí)受地區(qū)和寄主所驅(qū)動(dòng)，相似的特征也在的其他病毒中被報(bào)道過，比如馬鈴薯Y 病毒（，PVY）和辣椒脈斑駁病毒（，ChiVMV）[40-41]。TeMV分離物與地理（或寄主來源）是否存在關(guān)聯(lián)可以通過貝葉斯標(biāo)簽關(guān)聯(lián)顯著性（Bayesian tip-association significance，BaTS）分析進(jìn)行驗(yàn)證。然而，由于本研究中TeMV的樣本量相對(duì)有限。因此，后期可能需要更多不同地理或寄主來源的分離物以進(jìn)一步揭示該病毒的適應(yīng)性進(jìn)化特征。

4 結(jié)論

采用Indirect-ELISA、電鏡觀察、通用簡(jiǎn)并引物RT-PCR、特異性引物RT-PCR及序列測(cè)定相結(jié)合的方法，從福建西番蓮種植園內(nèi)檢出夜來香花葉病毒（TeMV）。針對(duì)TeMV，建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的分子快速檢測(cè)方法，為該病毒的快速檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支持。

[1] 徐麗, 張如蓮, 劉迪發(fā), 高玲. 西番蓮種子研究進(jìn)展. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 3(3): 57-59.

Xu L, Zhang R L, Liu D F, Gao L. The advance ofL. seeds., 2013, 3(3): 57-59. (in Chinese)

[2] 余東, 熊丙全, 袁軍, 曾明. 西番蓮種質(zhì)資源概況及其應(yīng)用研究現(xiàn)狀. 中國南方果樹, 2005, 34(1): 36-37.

Yu D, Xiong B Q, Yuan J, Zeng M. Present situation and application of germplasm resources of passion fruit., 2005, 34(1): 36-37. (in Chinese)

[3] 張佳艷, 任仙娥. 西番蓮果汁的研究進(jìn)展. 食品研究與開發(fā), 2016, 37(11): 219-224.

Zhang J Y, Ren X E. Progress in research on passion fruit juice., 2016, 37(11): 219-224. (in Chinese)

[4] 趙蘋, 焦懿, 趙虹. 西番蓮的研究現(xiàn)狀及在中國的利用前景. 資源科學(xué), 1999, 21(3): 77-80.

Zhao P, Jiao Y, Zhao H. Current situation on passion research and its utilization prospect in china., 1999, 21(3): 77-80. (in Chinese)

[5] 徐平東, 李梅, 柯沖. 福建西番蓮病毒病的發(fā)生及其病原黃瓜花葉病毒亞組鑒定. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1999, 26(1): 50-54.

Xu P D, Li M, Ke C. Occurrence of virus diseases ofspp. and subgrouping of cucumovirus in Fujian., 1999, 26(1): 50-54. (in Chinese)

[6] 徐平東, 李梅, 林奇英, 謝聯(lián)輝. 西番蓮死頂病病原病毒鑒定. 熱帶作物學(xué)報(bào), 1997, 18(2): 77-84.

Xu P D, Li M, Lin Q Y, Xie L H. Etiological identification of tip necrosis disease in passion fruit., 1997, 18(2): 77-84. (in Chinese)

[7] 莊西卿. 西番蓮病毒病. 福建熱作科技, 1989(3): 23-25.

Zhuang X Q. Passion fruit virus disease., 1989(3): 23-25. (in Chinese)

[8] Fukumoto T, Nakamura M, Wylie S J, Chiaki Y, Iwai H. Complete nucleotide sequence of a new isolate of passion fruit woodiness virus from Western Australia., 2013, 158(8): 1821-1824.

[9] Wylie S J, Jones M G. The complete genome sequence of aisolate from Australia determined using deep sequencing, and its relationship to other potyviruses., 2011, 156(3): 479-482.

[10] Garcêz R M, Chaves A L R, Eiras M, Meletti L M M, de Azevedo Filho J A, da Silva L A, Colariccio A. Survey of aphid population in a yellow passion fruit crop and its relationship on the spreadin a subtropical region of Brazil., 2015, 4: 537.

[11] Nascimento A V S, Santana E N, Braz A S, Alfenas P F, Pio-Ribeiro G, Andrade G P, de Carvalho M G, Murilo Zerbini F.(CABMV) is widespread in passionfruit in Brazil and causes passionfruit woodiness disease., 2006, 151(9): 1797-1809.

[12] Rodrigues L K, Silva L A, Garcêz R M, Chaves A L R, Duarte L M L, Giampani J S, Colariccio A, Harakava R, Eiras M. Phylogeny and recombination analysis of Brazilian yellow passion fruit isolates of: origin and relationship with hosts., 2015, 44(1): 31-41.

[13] Iwai H, Terahara R, Yamashita Y, Ueda S, Nakamura M. Complete nucleotide sequence of the genomic RNA of an Amami-O-shima strain of East Asian Passiflora potyvirus., 2006, 151(7): 1457-1460.

[14] Fukumoto T, Nakamura M, Rikitake M, Iwai H. Molecular characterization and specific detection of two genetically distinguishable strains of(EAPV) and their distribution in southern Japan., 2012, 44(1): 141-148.

[15] DE Wijs J J, Mobach J D. Passionfruit ringspot virus isolated fromin Ivory Coast., 1975, 81(4): 152-154.

[16] Coutts B A, Kehoe M A, Webster C G, Wylie S J, Jones R A. Indigenous and introduced potyviruses of legumes andspp. from Australia: biological properties and comparison of coat protein nucleotide sequences., 2011, 156(10): 1757-1774.

[17] Parry J N, Davis R I, Thomas J E., a novel virus infectingspp. in Australia and the Indonesian Province of Papua., 2004, 33: 423-427.

[18] Chang C A. Characterization and comparison of, a newly recognized potyvirus, with passionfruit woodiness virus., 1992, 82(11): 1358-1363.

[19] Benscher D, Pappu S S, Niblett C L, Varón de Agudelo F, Morales F, Hodson E, Alvarez E, Acosta O, Lee R F. A strain ofinfectingspp. in Colombia., 1996, 80(3): 258-262.

[20] Abdullah N, Ismail I, Pillai V, Abdullah R, Sharifudin S A. Nucleotide sequence of the coat protein gene of theand its 3′ non-coding region., 2009, 6(9): 1633-1636.

[21] Chiemsombat P, Prammanee S, Pipattanawong N. Occurrence ofcausing passion fruit severe mosaic disease in Thailand and immunostrip test for rapid virus detection., 2014, 63(5): 41-47.

[22] 徐平東, 李梅, 柯沖. 引致西番蓮環(huán)斑花葉和果實(shí)木質(zhì)化的一個(gè)黃瓜花葉病毒分離物鑒定. 植物病理學(xué)報(bào), 1996, 26(2): 164.

Xu P D, Li M, Ke C. Identification of an isolate ofcausing ringspot-mosaic and woodiness fruit in passionfruit., 1996, 26(2): 164. (in Chinese)

[23] 王海河, 謝聯(lián)輝, 林奇英. 黃瓜花葉病毒西番蓮分離物RNA3的cDNA全長(zhǎng)克隆和序列分析. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 30(2): 191-198.

Wang H H, Xie L H, Lin Q Y. Full-length cDNA cloning and the nucleotide sequencing of RNA3 ofisolate PE from passionflower., 2001, 30(2): 191-198. (in Chinese)

[24] Vaca-Vaca J C, Carrasco-Lozano E C, López-López K. Molecular identification of a new begomovirus infecting yellow passion fruit () in Colombia., 2017, 162(2): 573-576.

[25] Cheng Y H, Deng T C, Chen C C, Chiang C H, Chang C A. First report ofandon passion fruit in Taiwan., 2014, 98(12): 1746.

[26] Crestani O A, Kitajima E W, Lin M T, Marinho V L A. Passion fruit yellow mosaic virus, a new tymovirus found in Brazil., 1986, 76(9): 951-955.

[27] Moraes F H R, Belo W R F, Moraes G J, Kitajima E W. Occurrence of passion fruit green spot virus in the passion fruit crop in the State of Maranh?o, Brazil., 2006, 31(1): 100.

[28] Spiegel S, Zeidan M, Sobolev I, Beckelman Y, Holdengreber V, Tam Y, Bar Joseph M, Lipsker Z, Gera A. The complete nucleotide sequence ofand its phylogenetic relationship to other carlaviruses., 2007, 152(1): 181-189.

[29] St Hill A A, Zettler F W, Elliott M S, Petersen M A, Li R H, Bird J. Presence ofand a serologically distinct strain ofinspp. in Florida., 1992, 76(8): 843-847.

[30] Koenig R, Fribourg C E. Natural occurrence of tomato ringspot virus infrom Peru., 1986, 70(3): 244-245.

[31] Ha C, Coombs S, Revill P A, Harding R M, Vu M, Dale J L. Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses., 2008, 153(1): 25-36.

[32] Wylie S J, Nouri S, Coutts B A, Jones M G K.andfound infecting domestic and wild populations ofspecies in Australia., 2010, 155(7): 1171-1174.

[33] Ronquist F, Teslenko M, van der Mark P, Ayres D L, Darling A, Hohna S, Larget B, Liu L, Suchard M A, Huelsenbeck J P. MrBayes 3.2: Efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice acrossa large model space., 2012, 61(3): 539-542.

[34] Kalyaanamoorthy S, Minh B Q, Wong T K F, von Haeseler A, Jermiin L S. ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates., 2017, 14(6): 587-589.

[35] Cerqueira-Silva C B M, Concei??o L D H C S, Souza A P, Corrêa R X. A history of passion fruit woodiness disease with emphasis on the current situation in Brazil and prospects for Brazilian passion fruit cultivation., 2014, 139(2): 261-270.

[36] Zhang S Y, Yu N T, Wang X, Liang J, Xie H M, Wang J H, Zhang Y L, Liu Z X. Natural occurrence ofin wild eggplant in China., 2015, 163(11/12): 1023-1026.

[37] Ohshima K, Nomiyama R, Mitoma S, Honda Y, Yasaka R, Tomimura K. Evolutionary rates and genetic diversities of mixed potyviruses in., 2016, 45: 213-223.

[38] Noveriza R, Suastika G, Hidayat S H, Natsuaki K T. Molecular cloning and sequencing of(TeMV) causing mosaic disease on Patchouli., 2016, 15(2): 65-74.

[39] Adams M J, Antoniw J F, Fauquet C M. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family., 2005, 150(3): 459-479.

[40] Cuevas J M, Delaunay A, Rupar M, Jacquot E, Elena S F. Molecular evolution and phylogeography ofbased on the CP gene., 2012, 93(11): 2496-2501.

[41] Gao F L, Jin J, Zou W C, Liao F R, Shen J G. Geographically driven adaptation ofrevealed by genetic diversity analysis of the coat protein gene., 2016, 161: 1329-1333.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Molecular identification and specific detection ofinfecting passion fruit

XIE LiXue, ZHANG XiaoYan, ZHENG Shan, ZHANG LiJie, LI Tao

(FruitResearch Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013)

The objective of this study is to identify(TeMV) on passion fruit in Fujian orchard, develop a molecular method for specific and rapid identification of TeMV, and to provide a reference for prevention and control of the virus.The Fujian passion fruit samples were detected by using the serology method, electron microscopic observation, universal degenerate primers RT-PCR and specific primers RT-PCR. The PCR products of the positive sample were cloned and sequenced. A set of specific primes amplified the total length of coat protein (CP) gene was designed according to the sequences of reported TeMV and sequence determination of this study, and then specific primers RT-PCR detection method was established after optimizing reaction conditions. The sequence determination results were analyzed with BLAST program and DNAMAN software, and the phylogenetic tree was constructed based on the CP gene sequences obtained in this study by using Bayesian inference (BI) method implemented in MrBayes.The serology results showed that one passion fruit sample exhibiting mosaic and crinkle symptom reacted withantiserum. The positive sample was found to have about 750 nm×12 nm linear virions by electron microscopic observation. The expected fragment was amplified from the positive sample by universal degenerate primers RT-PCR, and then cloned and sequenced. Sequence analysis showed that the obtained sequence from the positive sample was identical with the expected size (680 bp), and shared the highest nucleotide sequence identity (98.2%) with the reported TeMV gene sequence. The full-length sequence of CP gene obtained by specific primers RT-PCR was 816 bp (named BXGFJ-13 isolate), and the sequence of nucleotide and amino acid of BXGFJ-13 was 86.2%-98.4% and 88.2%-97.8% identity, respectively, with the reported TeMV isolates. The results of phylogenetic analysis showed that the 13 TeMV isolates could be divided into 3 groups, and the same area or host derived isolates preferentially clustered together, suggesting these isolates had a strong geographical and host specificity. BXGFJ-13 isolate obtained in this paper and Guangxi isolate of China (KJ789129) clustered into a branch with high posterior probability, and then clustered together with two Thailand isolates (AM409188, AM409187) into the 2nd group (Group II), showing that BXGFJ-13 and Guangxi isolate had the closest phylogenetic relationship. The specific primers RT-PCR showed good specificity, which only amplify the expected fragment from TeMV-infected passion fruit sample, and no expected fragment was obtained from(CMV),(BtMV),(SMV),(OrMV),(OYDV),(EAPV) and healthy control. The sensitivity results showed that the target fragment could be amplified from diluted 102fold RNA.According to the species demarcation criteria for thegiven by International Committee on Taxonomy (ICTV) and the results of serological detection and electron microscopic observation, TeMV on the passion fruit sample exhibiting mosaic and crinkle symptom in Fujian orchard was confirmed. The establishedassayof specific RT-PCR could be used for rapid detection of TeMV.

passion fruit;(TeMV); molecular identification; detection

2017-09-26；

2017-10-25

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201410076）、福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)水果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位項(xiàng)目（閩農(nóng)科教〔2017〕129）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興特色果類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（STIT2017-2-4）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院管A類項(xiàng)目三農(nóng)業(yè)一融合（A2017-15）

謝麗雪，E-mail：xielx_faas@126.com。

李韜，Tel：0591-87573907；E-mail：leetao06@163.com