土壤含水量對硝化和反硝化過程N2O排放及同位素特征值的影響

鄭欠，丁軍軍，李玉中,2，林偉，徐春英，李巧珍，毛麗麗

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土壤含水量對硝化和反硝化過程N2O排放及同位素特征值的影響

鄭欠1，丁軍軍1，李玉中1,2，林偉1，徐春英1，李巧珍1，毛麗麗1

（1中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所/農業部旱地節水農業重點實驗室，北京 100081；2中國農業科學院環境穩定同位素實驗室，北京 100081）

通過室內培養試驗，研究不同含水量對北京順義潮褐土N2O排放及同位素特征值（δ15Nbulk，δ18O和nitrogen isotopomer site preference of N2O，簡稱SP）的影響，以期獲得不同水分條件下土壤N2O產生途徑及變化規律，為農田土壤N2O減排提供理論依據。結合穩定同位素技術與乙炔抑制法，以北京順義潮褐土為試材，設置3個含水量梯度：67%、80%和95% WFPS（土壤體積含水量與總孔隙度的百分比或實際重量含水量與飽和含水量的百分比，簡稱WFPS），在此基礎上設置無C2H2，0.1%（V/V）C2H2和10%（V/V）C2H2處理。將土壤裝入培養瓶中培養2 h，之后收集培養瓶中的氣體測定N2O濃度及同位素特征值，并采集土樣測定其NH+ 4-N和NO- 3-N的含量。利用同位素二源混合模型計算硝化和反硝化作用對土壤N2O排放的貢獻率，對N2O產生途徑進行量化分析。根據室內土壤培養測定結果，高（95% WFPS）、中（80% WFPS）和低（67% WFPS）含水量土壤N2O加權平均排放通量分別為1.17、0.27和0.08 mgN·kg-1·d-1，高含水量土壤N2O排放量均顯著高于中、低含水量處理，中含水量處理顯著高于低含水量；整個培養周期，高、中和低含水量土壤N2O+N2累積排放量分別為培養初期總的無機氮含量的18.05%、5.27%和1.24%（N2O+N2累積排放量分別為19.61、5.72和1.35 mgN·kg-1；各處理NH+ 4-N+NO- 3-N初始含量均為108.62 mgN·kg-1）；與低含水量處理相比，高、中含水量土壤的N2O+N2累積排放量分別增加了13.53倍和3.24倍，高含水量土壤N2O+N2累積排放量比中含水量高2.43倍，表現為隨著含水量的增加，土壤無機氮（NH+ 4-N+NO- 3-N）以氣態氮（N2O+N2）形式的損失量逐漸增加。3個含水量處理N2O的δ15Nbulk加權平均值變化范圍為-42.93‰—-4.07‰，且較高含水量處理顯著低于較低含水量處理；10%（V/V）C2H2抑制土壤中N2O還原成N2的過程，各含水量土壤中，10%（V/V）C2H2處理組其N2O的δ18O值顯著低于0.1%（V/V）C2H2處理組，且N2O/（N2O+N2）比率隨土壤含水量增加而降低；各處理土壤中同時存在多個N2O產生過程，對于培養第一周，土壤產生的N2O的SP值于培養前4 d呈逐漸增加的趨勢，之后又逐漸降低，低含水量土壤在第1—2 天產生的N2O的SP值為6.74‰—12.04‰，反硝化作用對土壤N2O排放的貢獻率為56.36%—66.15%，此培養階段表現為土壤主要通過反硝化作用產生N2O，之后，硝化作用貢獻率（55.78%—100%）增強；中含水量土壤N2O的SP加權平均值為10.26‰，該土壤中反硝化作用（40.90%—74.04%）占據主導地位；加10%（V/V）C2H2的高含水量處理，在整個培養第一周均具有較高的SP值，變化范圍為7.61‰—21.11‰；與0.1% （V/V）C2H2處理組相比，10%（V/V）C2H2處理的高、中和低含水量土壤排放N2O的SP加權平均值分別降低了0.10倍、0.33倍和0.06倍。土壤含水量增加促進N2O排放，高含水量處理中N2O排放量最高。67%WFPS處理中，N2O排放前期以反硝化作用為主，后期以硝化作用為主；80%WFPS處理中，N2O主要由反硝化過程產生；95% WFPS處理中，N2O排放以硝化作用為主。

土壤孔隙含水量；N2O；硝化作用；反硝化作用；穩定同位素；同位素位嗜值

0 引言

【研究意義】N2O是一種重要的溫室氣體，其全球增溫潛勢是CO2的300倍[1]。農田生態系統是大氣N2O的主要來源，對全球N2O排放（17.7 Tg N2O-N·a-1）的貢獻為6.2 Tg N2O-N· a-1，約占全球N2O排放量的1/3[2]。微生物的硝化作用和反硝化作用是土壤主要的N2O產生途徑，這些過程受土壤含水量、溫度、通氣性、銨態氮和硝態氮濃度、可礦化碳的含量以及pH的影響[3-4,5]，其中，土壤水分含量是N2O排放來源的主要控制因素[6]，不同含水量下，這些過程可能會在同一土壤中的不同微區同時發生[7]，但是對于土壤中N2O的主要產生途徑仍具有不確定性。因此，不同濕度土壤N2O溯源研究對于N2O減排具有重要指導意義。【前人研究進展】土壤含水量為84%—86% WFPS時，N2O排放量最強；低于這個范圍時，土壤含水量與N2O排放量呈正相關，反之，則呈負相關關系[8]。施加氮肥后，土壤N2O排放量隨著土壤含水量的增加而增加，通常當土壤含水量低于70%WFPS時，硝化作用成為主要的N2O來源[7, 9-10]。用15N標記NO- 3的研究發現，當土壤含水量大于70%WFPS時，其產生的N2O主要由反硝化作用產生[10-11,12]。也有研究指出，只有當含水量超過80%WFPS時，反硝化作用才會成為主要的N2O產生途徑[13]。乙炔（Acetylene，C2H2）是一種常用的自養硝化抑制劑，較低的乙炔濃度（1—100 Pa）可以抑制土壤的自養硝化作用，較高的乙炔濃度（10 kPa）可以抑制N2O還原成N2，同時也能抑制硝化作用，而異養硝化作用在較大的乙炔濃度范圍（1—10 kPa）不受抑制[14-15]。以往研究，主要利用乙炔抑制技術和同位素標記技術區分N2O產生和消耗過程，但是這些技術存在局限性[16-18]。目前，國外將同位素位嗜值（site preference，SP），作為N2O溯源研究的重要工具。理論上，參與硝化和反硝化過程產生的N2O的NO還原酶類型不同，會導致兩個N原子位置15N的富集程度不同[19-20]；N2O還原過程中N-O鍵斷裂會導致剩余N2O中間位置氮原子富集15N（15Nα）[19,21-23]，這些均可以作為利用SP值區分N2O來源的理論基礎。除此之外，SP值可以彌補δ15N和δ18O受前體同位素值干擾的不足，且對樣品干擾小[24-26]。與細菌反硝化作用相比，由真菌反硝化作用和硝化作用產生N2O過程具有更高的SP值[27]。與硝化作用相比，一般土壤反硝化過程產生的N2O有較高的δ15N和δ18O值[28]。國外研究發現，在55% WFPS處理中，有一多半的N2O來自于硝化作用，75%和85%WFPS土壤中反硝化作用是主要的N2O產生途徑[29]。【本研究切入點】國內很少利用自然豐度的穩定同位素特征值對參與N2O排放的硝化和反硝化過程貢獻率進行量化研究，本研究利用該技術結合乙炔抑制法探索不同土壤含水量下N2O的溯源問題。【擬解決的關鍵問題】本研究將同位素自然豐度法與乙炔抑制技術相結合，通過室內培養試驗，研究不同含水量（WFPS）對北京順義潮土N2O排放及同位素特征值（δ15Nbulk，δ18O和SP）的影響，以期獲得不同土壤含水量條件下施用銨態氮肥后，其N2O產生途徑及變化規律。

1 材料與方法

試驗于2016年10—11月在中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所環境穩定同位素實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試土壤來自中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所北京順義試驗基地，為連續10年以上小麥與玉米一年兩熟種植制度的潮褐土，其玉米和小麥的產量分別約為8 250和6 000 kg·hm-2。玉米收獲后的0—20 cm表層土壤的主要理化性質為：容重1.48 g·cm-3、pH 7.87、有機質15.40 g·kg-1、NH+ 4-N 2.33 mg·kg-1、NO- 3-N 6.33 mg·kg-1。采用蛇形五點法收集土樣，土壤取回后，過4 mm篩，稍微風干后，混勻，便開始進行培養。C2H2購自北京氦普北分氣體工業有限公司（純度≥99.6%）。

1.2 試驗方法

試驗設置3個含水量梯度，分別為67%、80%和95%WFPS（土壤體積含水量與總孔隙度的百分比或實際重量含水量與飽和含水量的百分比，簡稱WFPS），每個含水量梯度設置不加C2H2（CK）、加0.1%（V/V）C2H2和加10%（V/V）C2H2，共9個處理，每個處理均設有3次重復。

向土壤中添加肥料用量為100 mgN·kg-1烘干土的(NH4)2SO4，拌勻。土壤初始含水量為67% WFPS，根據重量法通過加蒸餾水調成80%和95% WFPS，得到3個含水量梯度，將土樣裝于無蓋的塑料盒子里，表面覆膜，并扎若干個6 mm的小孔，以減緩水分蒸發，培養過程中根據重量法每3天補加一次蒸餾水，使土壤含水量與培養初期保持一致，于25℃培養箱進行黑暗培養。在培養第1、2、3、4、5、7、10、14和18天進行氣體和土壤樣品收集。具體采樣過程為：稱取高（95% WFPS）、中（80% WFPS）和低（67% WFPS）含水量的土壤樣品分別為51.6、49.6和48.0 g（均相當于40 g烘干土）于280 mL培養瓶中，培養瓶蓋上膠塞，并用鋁蓋壓緊密封。0.1%（V/V）C2H2處理用注射器注入0.3 mL C2H2，并混勻；10%（V/V）C2H2處理用注射器從培養瓶中抽出30 mL 空氣，再注入30 mL C2H2，并混勻。將處理好的培養瓶于25℃培養箱中黑暗培養2 h，從培養瓶中用注射器抽取20 mL氣體（加C2H2的處理采氣前要將培養瓶中的氣體混勻），注入20 mL提前抽成真空狀態的頂空瓶中用于測定N2O濃度及同位素值（δ15Nbulk和δ15Nα），同時收集培養瓶中的土樣，于-20℃冷凍，用于測定土壤氮素含量。

無C2H2處理的土壤N2O由硝化和反硝化作用共同產生；0.1%（V/V）C2H2處理的土壤N2O均由反硝化作用產生；10%（V/V）C2H2處理的土壤N2O是反硝化作用產生的N2O與N2之和。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 N2O排放通量及同位素特征值的測定 利用穩定同位素質譜儀（IRMS, Isoprime100, Isoprime，Cheadle，UK）配合痕量氣體濃縮系統（Trace Gas, UK）測定N2O峰面積（m/z=44，具體參照文獻中提到的方法[30-31]，根據樣品N2O和采樣時空氣中N2O峰面積比值算出樣品中N2O濃度。N2O排放通量計算公式[32]為

式中，表示N2O排放速率，μg·kg-1·d-1；表示標準狀況下N2O的密度，1.25 kg·m-3；為培養瓶內有效體積，0.24 L；?表示測定的N2O濃度，ppbv；?表示每次取樣培養時間，2 h；為干土重量，40×10-3kg；表示培養時的平均溫度，25℃；24表示一天24 h；N2O累積排放量為不同培養時間段氣體排放量的加權求和，μg·kg-1。

N2O同位素特征值（δ15Nbulk和δ15Nα）利用1.3.1中提到的IRMS進行測定得到。

N2O分子是不對稱的直線型結構，根據中間和末端氮原子的不同，分別稱為α原子和β原子[23]，微生物對N2O分子內不同位置N的嗜好性差異產生的值稱為位嗜值，簡稱SP。N2O同位素特征值相關公式[30]如下

（i=bulk,α） （2）

式中，R=15N/14N，18O/16O，R的下角標分別表示樣品和標準樣品。

N2O的同位素位置嗜值SP的計算公式[30]為

式中，δ15Nα和δ15Nβ分別表示N2O分子內α和β位氮原子的同位素值。

1.3.2 基于SP的N2O來源評估 假設土壤排放的N2O全部來自于硝化作用和反硝化作用，利用同位素二源混合模型計算硝化和反硝化作用各自的貢獻率，公式[29]如下

式中，SPE和SPN、SPD分別表示環境樣品的SP值以及純細菌培養條件下硝化和反硝化作用各自的SP值（33‰和0），N和D分別表示來自硝化和反硝化作用的N2O占總量的比例。

1.3.3 土壤無機氮含量的測定 QuikChem 8000 流動注射全自動分析儀（LACHAT，USA）測NH+ 4-N和NO- 3-N體積含量（mg·L-1），并計算出質量含量（mg·kg-1），測定方法和公式參照《土壤農化分析》[33]。

1.4 數據處理及分析

采用Microsoft Excel 2013和SAS 9.2軟件進行數據分析和處理，采用Sigmaplot 12.5進行數據的統計和作圖，利用LSD（=0.05）法對處理間差異進行顯著性分析。

2 結果

2.1 N2O排放速率與累積排放量

本研究結果表明，土壤N2O排放速率隨著土壤含水量升高而增加（圖1-A）。在80%、95% WFPS條件下，各處理間土壤N2O排放速率在培養第2—4天出現排放高峰，并且其最大排放速率分別為1.46和3.30 mgN·kg-1·d-1，隨后N2O排放速率逐漸降低。67% WFPS土壤N2O整體排放水平比較低（低于0.20 mgN·kg-1·d-1），在培養第1—2天出現較高的N2O排放量。高、中和低含水量土壤N2O加權平均排放通量分別為1.17、0.27和0.08 mgN·kg-1·d-1。其中，高、中含水量土壤在培養前7—10 d具有較高的N2O排放速率，之后排放速率較低且變化不大。低含水量各處理間N2O排放速率差異顯著，且無C2H2處理>10%（V/V）C2H2處理>0.1%（V/V）C2H2處理（表1）。

整個培養周期，高、中和低含水量土壤N2O累積排放量分別為21.06、4.77和1.48 mgN·kg-1，分別為培養初期總的無機氮含量的19.39%、4.39%和1.36%（NH+ 4-N+NO- 3-N初始含量均為108.62 mgN·kg-1），這說明，隨著土壤含水量增大，氣態氮損失量增加；高、中含水量土壤N2O累積排放量分別比低含水量高13.23和2.22倍，高含水量土壤N2O累積排放量比中含水量高3.42倍。各水分處理間N2O累積排放量均達到顯著水平（＜0.01）。

各含水量土壤，無C2H2處理N2O累積排放量均顯著高于0.1%（V/V）C2H2處理（＜0.01），這說明0.1%（V/V）C2H2處理有效抑制了硝化過程中的自養氨氧化過程；同時，10%（V/V）C2H2處理N2O累積排放量均顯著高于0.1%（V/V）C2H2處理（＜0.01），這表明10%（V/V）C2H2處理有效抑制了N2O還原成N2的過程（表1）。

誤差線表示標準誤（n=3）.下同

表1 兩種C2H2處理對土壤N2O排放速率及累積排放量的影響

CK：無C2H2處理；ER：N2O排放速率；CE：N2O累積排放量。為了方差分析準確性，保留了小數點后4 位。同一列中不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05）。下同

CK: Without C2H2treatmen; ER: Emission rate of N2O; CE: Cumulative emissions of N2O. In order to improve the accuracy of the variance analysis, 4 decimal places were reserved. The values followed by different little letters in the same column indicate the significant differences between treatments at＜0.05 level. The same as below

2.2 土壤中無機氮NH+ 4-N和NO- 3-N含量的變化

培養期間，土壤中NH+ 4-N和NO- 3-N濃度變化說明了氮的轉化過程。各處理土壤NH+ 4-N濃度大體上均呈逐漸下降趨勢。中、低含水量處理，土壤NH+ 4-N濃度在培養開始后急劇下降，至培養第3天分別降低了95.54%和97.22%，之后稍有波動，但變化不大。高含水量處理NH+ 4-N濃度與另外兩個處理相比下降緩慢，到培養第3和10天分別減少了49.85%和77.89%（圖2-A）。

土壤NO- 3-N含量在整個培養周期呈增加的趨勢。中、低含水量處理，土壤中NO- 3-N濃度從培養開始至第3天迅速升高，之后未出現明顯變化。至培養第18天，高、中和低含水量處理NO- 3-N濃度分別為80.66、101.54和100.03 mgN·kg-1（3個含水量NO- 3-N初始含量均為6.29 mgN·kg-1），高含水量處理與中、低含水量處理間差異顯著（=0.0086），中低含水量處理間差異不顯著（圖2-B）。

2.3 不同乙炔處理下反硝化產物N2O和N2O+N2的產生規律

N2O還原成N2的途徑對于了解農業土壤中N2O消耗非常重要，并且這可能是一個考慮如何減緩N2O排放的方向。0.1%(V/V）C2H2抑制自養氨氧化作用，10%（V/V）C2H2抑制N2O還原成N2，同時抑制自養氨氧化作用。本研究通過分析0.1%（V/V）C2H2和10%（V/V）C2H2處理組N2O排放通量來估測可能的反硝化產物（N2O+N2）排放量以及N2O/（N2O+N2）比率。培養期間，土壤反硝化作用產生的N2O和（N2O+N2）加權平均排放通量，高含水量處理（分別為0.85和1.11 mgN·kg-1·d-1）顯著高于中（分別為0.22和0.33 mgN·kg-1·d-1）、低含水量處理（分別為0.06和0.08 mg·N·kg-1·d-1），兩個較低含水量處理間也均達顯著水平（均為＜0.0001；表1）。高、中和低含水量土壤N2O/（N2O+N2）比率分別為0.61、0.72和0.86，并且各水分處理間差異顯著（＜0.0001），這說明，在67%WFPS處理下，只有14%的N2O還原成了N2，大部分以N2O形式排放到了外界環境中（表1）。

圖2 不同含水量土壤培養期間NH+ 4-N(A)和NO- 3-N(B)含量

2.4 土壤N2O的同位素特征

N2O峰值一般出現在施肥后一周內[34]。因此，以下探討了培養第一周期間N2O同位素特征。N2O同位素特征值受土壤含水量的影響顯著（圖3）。對于N2O的δ15Nbulk和δ18O，各含水量處理間差異均達顯著性水平（＜0.0001）。高、低含水量處理的SP值顯著高于中含水量（＜0.0001）。所有處理下δ15Nbulk平均值均為負值，變化范圍為從-43.95‰到-5.31‰，δ18O和SP平均值均為正值，變化范圍分別為12.28‰—40.66‰以及10.30‰—21.58‰。土壤含水量對N2O同位素特征值影響利用相關性進行分析發現，WFPS與δ15Nbulk具有顯著負相關關系（=-0.77，＜0.0001），另外，其與δ18O和SP均無顯著相關性；SP與δ15Nbulk呈顯著正相關（=0.34，＜0.01），與δ15Nbulk相比，SP與δ18O相關性更加顯著（=0.56，＜0.0001）；δ15Nbulk和δ18O具有顯著正相關關系（=0.61，＜0.0001）。

土壤排放N2O的δ15Nbulk值隨著土壤含水量的增加而減小（圖3）。根據同位素分餾效應，添加NH+ 4會誘導土壤發生硝化作用，隨著硝化作用進行，剩余底物會富集重同位素，導致NH+ 4的δ15N增加，這可能會促使N2O的δ15Nbulk發生顯著變化，因此，可能會使利用δ15Nbulk區分N2O產生途徑復雜化。研究發現，3個含水量在無C2H2處理下N2O的δ15Nbulk在培養第一周均呈增加趨勢，變化范圍為-54.78‰—3.62‰，這與之前的研究一致，即施用尿素和銨態氮肥料后，N2O的δ15Nbulk通常會隨著培養時間升高[35-36]。δ15Nbulk加權平均值為高含水量（-42.93‰）＜中含水量（-28.81‰）＜低含水量（-4.07‰），且各水分處理間差異顯著（＜0.0001）。

圖3 不同含水量土壤培養第一周N2O同位素特征值（δ15Nbulk，δ18O和SP）

表2 兩種C2H2處理對土壤N2O 同位素特征值（δ15Nbulk,δ18O, SP）的影響

2.5 基于SP值的硝化和反硝化過程對土壤N2O排放的貢獻率

不加C2H2各處理SP值在培養第一周均呈先升高再下降的趨勢（圖3）。高、中和低含水量土壤N2O的SP加權平均值，不加C2H2處理下分別為20.70‰、10.26‰和21.07‰，這與之前純培養研究相比，高于反硝化作用SP值（-10‰—0‰），低于硝化作用SP值（33‰—37‰）[39]，這說明在各含水量土壤中可能同時具有多個N2O產生途徑。0.1%（V/V）C2H2處理下高、中和低含水量的SP加權平均值分別為17.38‰、8.88‰和19.96‰，10%（V/V）C2H2處理下，高（15.71‰）、中（5.95‰）和低（18.67‰）含水量土壤N2O的SP加權平均值分別比0.1%（V/V）C2H2處理降低了10%、33%和6%。該結果表明，反硝化過程中可能發生N2O還原（表2）。低含水量處理的SP值在培養前兩天均較低（分別為6.74‰和12.04‰），以反硝化作用為主，分別占N2O生成量的66.15%和56.36%；之后主要以硝化作用為主；中含水量土壤的SP值在培養第1—7天均較低（3.92‰—15.21‰），N2O主要由反硝化作用產生，由反硝化作用排放的N2O貢獻率為40.90%—74.04%（表3）；高含水量處理10%（V/V）C2H2的SP值在培養第一周比較高（7.61‰—21.11‰），而添加10%（V/V）C2H2處理會抑制自養氨氧化過程以及N2O還原成N2過程，故該處理不會因此出現較高的SP值，這說明可能發生了部分真菌反硝化作用。MAEDA等通過研究67種真菌發現其SP平均值為30‰±4.8‰（測得的SP值范圍為15.8‰—36.7‰）[40]。

3 討論

土壤含水量是控制N2O排放的主要因素[41]，它對N2O產生途徑及同位素組成均具有顯著影響。該研究表明土壤N2O排放量隨土壤含水量的增加而增加，這與前人的研究結果一致[42-44]。含水量從67%升高到95% WFPS，土壤N2O排放量出現顯著增加。這與溫帶大田土壤的研究結果相似，Clayton通過研究草地土壤發現，65% WFPS是一個重要臨界點，當超過該含水量，土壤N2O排放量出現顯著增加[45]。溫帶草地和農田土壤含水量從60%升到80% WFPS時，N2O排放量分別增加了12倍和30倍[41]，這與本研究結果相似，高、中含水量土壤N2O累積排放量分別比低含水量處理高13.23倍和2.22倍，這可能是由于隨著土壤含水量（WFPS）的增加，水不斷充滿土壤孔隙，O2向土壤中擴散受到限制，土壤的厭氧條件逐漸增強并促進反硝化作用，N2O也隨之大量產生并排放出土壤[46-47]。隨著土壤含水量（WFPS）增加，N2O排放量增加，在含水量為80%—95% WFPS條件下出現最大的N2O排放量[48]。當土壤水勢達到-5 kPa（約為97% WFPS），出現最大的N2O排放量，土壤含水量（-2.5 kPa）進一步增加，N2O產生量減少，可能是由于N2O還原速率增加[49-50]。但是，也有研究提出在70% WFPS下出現較高的N2O排放量[11]。Davidson研究發現，最大N2O排放量產生于60% WFPS，硝化作用和反硝化作用對N2O產生均具有重要作用[6]。出現該矛盾原因可能是由試驗和土壤類型的不同導致。

表3 不同含水量土壤硝化和反硝化作用對N2O排放的貢獻率

同一土體中可以同時發生多個N2O產生過程，利用穩定同位素與C2H2（0.1%和10%V/V）抑制相結合的方法可以確定自養硝化作用和反硝化作用對土壤N2O排放的貢獻率。本研究發現自養硝化作用和反硝化作用對土壤排放N2O的貢獻率隨著土壤含水量的變化而有所不同，但絕對貢獻率因所選擇的方法不同有很大的差異。僅利用乙炔抑制技術估測的反硝化作用（含水量為67%—80% WFPS時貢獻率為82%—83%）對N2O排放貢獻率大于同位素技術（含水量為67%—80% WFPS時貢獻率為32%—58%）測得的結果，利用兩種方法估測反硝化作用對N2O排放的貢獻率，大于25%的差異僅出現在67% WFPS條件下，這有可能是乙炔抑制技術忽略了異養硝化作用對土壤排放N2O的貢獻。但是，不同途徑對土壤N2O排放的貢獻隨著土壤含水量的變化趨勢是相同的。

在大部分生態系統中，反硝化作用是主要的N2O產生途徑。其最后一步是N2O還原酶將中間產物N2O還原成N2的過程，這步反應對估測N2O消耗、了解土壤中氮積累和排放到大氣中的氣態氮量至關重要，并且這可能是如何減緩N2O排放的重要方向。反硝化產物N2O/（N2O+N2）比率用于評估N2O轉化為N2的程度，變化范圍從0（所有的N2O全部轉化為N2）到1（N2O是反硝化過程的唯一最終產物）[51]。本研究發現，土壤含水量越高，土壤排放的N2O轉化成N2的比例越高，土壤排放到外界環境的N2O絕對量也越高。這將會導致更多的N2O排放到大氣中，加劇溫室效應。之前的一些研究也提出較高含水量的土壤出現最大的N2O排放量[8,48]，這與本研究結果一致。這說明可以通過控制土壤水分條件來減緩N2O排放。

一些文獻報道δ15Nbulk是區分硝化作用和反硝化作用的重要指標，這是因為與反硝化作用相比，硝化作用會加速δ15N-NO- 3貧化[35,52]，其他學者主張δ15Nbulk取決于底物來源NH+ 4和NO- 3以及土壤異質性，并沒有考慮N2O還原過程對剩余N2O的影響[28,53]。本研究發現施用NH+ 4后，由于硝化過程中同位素分餾導致δ15Nbulk值隨著培養時間逐漸升高。底物（NH+ 4）充足，硝化作用產物NO- 3受底物影響，根據同位素分餾原理，微生物優先利用輕同位素，導致δ15N-NO- 3逐漸貧化，而發生反硝化作用的底物幾乎全部來自于硝化作用產物（NO- 3），故反硝化作用占據主導地位的較高土壤含水量，其δ15Nbulk值越低，本研究顯示δ15Nbulk值隨著含水量的增加而降低（δ15Nbulk加權平均值，95% WFPS處理＜80% WFPS處理＜67% WFPS處理）。

δ18O值受N2O向N2還原過程的影響，同時O2，H2O與NO- 3之間的O原子交換也會影響其大小[54-55]。與δ15Nbulk和SP相比，對N2O分子中δ18O的解釋更為復雜[56]。N2O-O可能來源于不同途徑，理論上，硝化細菌-反硝化過程中（NH+ 4→NH2OH→NO- 2→NO→N2O）一半的氧原子來自于空氣中O2，另一半氧原子來自于H2O，羥胺氧化過程中，100%的N2O-O來源于O2[54]。如果反硝化細菌利用NO- 3產生N2O，那么N2O中所有的O都來自于NO- 3。但是在實際環境中，H2O-O與NO- 2-O和NO- 3-O發生氧交換，且H2O-O和NO- 3-O對N2O-O的貢獻與微生物種類有關[55]。基于以上理論和研究結果，采用δ18O-N2O值對N2O來源進行分析比較復雜，需要考慮多種因素。本試驗中，δ18O與乙炔抑制技術相結合，提高了其準確性。各含水量土壤中，0.1%（V/V）C2H2處理組的δ18O值顯著高于10%（V/V）C2H2處理組（＜0.01），這可能是由于兩種處理土壤中均主要發生反硝化作用，只是10%（V/V）C2H2會抑制土壤中N2O還原成N2的過程，而反硝化作用會消耗土壤中的NO- 3，并使土壤中剩余NO- 3富18O，增加其δ18O值。有研究提出，反硝化過程中發生N2O還原會使N-O鍵斷裂，導致剩余N2O相對富集δ15Nα和δ18O[34,37-38]。盡管一些研究中利用δ18O來區分N2O產生途徑[53,57]，但是只依靠δ18O-N2O 值對N2O來源進行分析仍備受爭議，如果δ18O與其他同位素值（如δ15N，SP）結合來分析，可能會提高其準確性。

與δ15Nbulk和δ18O相比，SP值是區分土壤N2O排放途徑的一種重要工具，其優勢在于受樣品干擾小，與N2O前體的δ15N同位素組成沒有相關關系[24-2526]。一般隨著土壤含水量（WFPS）的增加，土體的厭氧體積逐漸增大并使反硝化作用加強，N2O也隨之大量產生并排放出土壤[46-47]。本研究高含水量處理厭氧體積高于中含水量處理，其SP值之所以高于中含水量處理，可能是發生了部分真菌反硝化作用[27]。Maeda等[40]通過對67種真菌測試發現，其SP平均值為30.0‰±4.8‰（變化范圍為15.8‰—36.7‰）[40]。另有文獻報道真菌產生N2O的SP值為36.9‰—37.1‰，這與細菌硝化作用的相似（34.1‰—39.6‰）[27]。

本研究利用同位素技術結合乙炔抑制技術，高含水量處理中，加10%（V/V）C2H2只發生反硝化作用，其會抑制自養氨氧化過程和N2O還原成N2的過程，故該處理不會因為這兩個過程而產生較高的SP值[26]，而95% WFPS在10%（V/V）C2H2條件下土壤排放N2O的SP加權平均值為15.71‰，這正說明高含水量處理中發生部分真菌反硝化作用。與細菌反硝化作用相比，真菌反硝化作用和硝化作用排放N2O的過程均會產生較高的SP值[27]。因此，利用同位素技術區分細菌硝化作用和真菌反硝化作用產生的N2O遇到挑戰[27]。另外，較高土壤含水量更有利于反硝化反應的發生，而施加硫酸銨后，雖然同樣產生厭氧環境，由于硫酸銨提供大量可利用氮，在土壤表層硝化反應得到促進。除此之外，SP值會隨著N2O還原過程發生變化，使對N2O產生途徑評估產生偏差。由完全的硝化作用和細菌反硝化作用產生N2O的SP值，分別約為33‰和0‰，還原過程會使SP值升高[26]，這與本研究結果一致。高、中和低含水量土壤，10%（V/V）C2H2處理組N2O累積排放量分別比0.1%（V/V）C2H2處理增加了26%、40%和16%，說明未加10%（V/V）C2H2處理的土壤發生N2O還原過程；同時，與10%（V/V）C2H2處理相比，0.1%（V/V）C2H2處理下高、中和低含水量的SP加權平均值分別升高了11%、49%和7%，這正驗證了該理論。根據同位素二源混合模型，以上過程會使由SP值估測的N2O產生途徑低估反硝化作用對N2O排放的貢獻[26,58]。

與示蹤技術相比，利用自然豐度同位素技術（例如SP值的運用）不需要人為標記培養、操作方便，具有明顯優勢。但是微生物氮循環過程相當復雜，對SP值用于區分N2O產生途徑的方法應慎重利用，如硝酸鹽異化還原成銨和異養硝化作用也會產生N2O[11,59-60]，并影響氮循環過程中一些含氮化合物的同位素特征值。目前為止，這些過程對土壤產生N2O的15N的SP值的影響還不明確[61]。因此，本研究并未對這些過程對SP值的影響進行分析。雖然SP值在應用中存在一些不足，但其確實是一種有效的N2O溯源方法，并已在國際上得到廣泛認可。當下中國對SP值研究剛剛起步，本文對其進行初步探討，接下來將進一步探究微生物群落結構及其酶組成對土壤產生N2O的同位素特征值隨時間變化的影響，從而能提高利用SP值區分N2O產生途徑的準確性；另外，土壤反硝化的NO- 3還原成N2O過程中，真菌和細菌反硝化作用對土壤產生N2O的貢獻及其對SP值變化的影響，也需要做進一步研究。

4 結論

本試驗將自然豐度的同位素技術與乙炔抑制技術相結合測定不同含水量（WFPS）下硝化作用和反硝化作用對土壤N2O排放的貢獻率。隨著土壤含水量增大，N2O排放量增加。各處理均在前4天具有較高的N2O排放量，之后排放量相對較小，并且變化不大。隨著土壤含水量增加，N2O/（N2O+N2）比率降低，土壤以N2O形式排放到大氣中的比例降低，以N2形式排放到大氣中的比例升高，N2O還原過程增強。本研究通過SP值估算硝化和反硝化作用的貢獻率得出，培養前7 d內，67% WFPS土壤N2O排放以硝化作用為主，且在前2 d以反硝化作用為主，之后主要通過硝化作用排放N2O。在一定范圍內，含水量升高會使反硝化作用增強。

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（責任編輯 李云霞）

The Effects of Soil Water Content on N2O Emissions and Isotopic Signature of Nitrification and Denitrification

ZHENG Qian1, DING JunJun1, LI YuZhong1,2, LIN Wei1, XU ChunYing1, LI QiaoZhen1, MAO LiLi1

(1Institue of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Dryland Farming Agriculture, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;2Environmental Stable Isotope Laboratory, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

The objective of this paper is to understand the contribution of microbial processes to N2O production and its changing rules under different water contents to provide a theoretical basis for reducing agricultural N2O emissions.A microcosm experiment was performed to investigate the effects of different water-filled pore space on N2O emissions and isotopic signatures (δ15Nbulk, δ18O and nitrogen isotopomer site preference of N2O) of soil at Shunyi district, Beijing. The study combined stable isotope technique and gas inhibitor method to analyze N2O flux and its isotope signatures that emitted from soil. The experiment was set up three different water content levels, including 67%, 80% and 95% WFPS, and with three inhibitor levels, (without C2H2, with 0.1% (V/V) C2H2and with 10% (V/V) C2H2). After two hours incubation, the soil samples were collected to determine the concentrations of NH+ 4-N and NO- 3-N. The gas samples were collected to determine the isotope signatures, and the two end-members mixing model was applied to quantify the respective contributions of microbial processes to N2O production.According to the incubation of the soil, the weighted average N2O flux of 95%, 80% and 67% WFPS were 1.17, 0.27 and 0.08 mgN·kg-1·d-1, respectively, and the N2O emissions of 95% WFPS were significantly higher than that of both 80% and 67% WFPS, as well as the N2O emissions of 80% WFPS were significantly higher than that of 67% WFPS. The cumulative emissions of (N2O+N2) in 95%, 80% and 67% WFPS were 18.05%, 5.27%, and 1.24% of initial mineral nitrogen, respectively, over the entire incubation period. The cumulative emissions of (N2O+N2) were 19.61, 5.72 and 1.35 mgN·kg-1, respectively; the initial content of NH+ 4-N+NO- 3-Nwas 108.62 mgN·kg-1. Compared with 67% WFPS, the cumulative (N2O+N2) emissions of 95% and 80% WFPS increased 13.53 and 3.24 times, respectively. The cumulative emissions of (N2O+N2) in 95% WFPS was 2.43 times greater than that of 80% WFPS. The values of reduced NH+ 4-N+NO- 3-N as gaseous nitrogen increased with the increase of the water content. The weighted average δ15Nbulkvalues varied from -42.93‰ to -4.07‰, and the higher level of soil water content showed significantly higher N2O emissions. 10% (V/V) C2H2would inhibit the reduction of N2O to N2. The δ18O values with 10% (V/V) C2H2were significantly smaller than that of with 0.1% (V/V) C2H2in three water content levels. And the ratio of N2O/(N2O+N2) reduced with the increase of soil moisture. Multiple N2O processes occurred simultaneously in all treatments. The values of SP increased during the initial four days and then decreased gradually with incubation time. The SP values of 67%WFPS treatment at the first two days ranged from 6.74‰ to 12.04‰, and the contribution of denitrification to N2O production was from 56.36% to 66.15%, suggesting that denitrification was the dominant microbial process, then the contribution of nitrification (55.78%-100%) to N2O production became greater. The weighted average SP value was 10.26‰ in 80% WFPS treatment, indicating denitrification (40.90%-74.04%) was the major N2O production process. There were larger SP values in 95% WFPS treatment with 10% (V/V) C2H2in the first seven incubation days, ranged from 7.61‰ to 21.11‰. Compared with 0.1% (V/V) C2H2, the weighted average SP values of N2O under 95%, 80% and 67% WFPS treatments with 10% (V/V) C2H2produced from soil reduced by 0.10, 0.33 and 0.06 times respectively.The increase of soil water content promotes N2O emission, and the 95% WFPS treatment showed the highest N2O emissions. In the 67% WFPS treatment, the initial stage of N2O emission was dominated by denitrification, followed by nitrification. Denitrification was the dominate process in 80% WFPS treatment and nitrification was the dominate process in 95% WFPS treatment.

water-filled pore space (WFPS); N2O; nitrification; denitrification; stable isotope; site preference value (SP value)

2017-06-06；

2017-08-15

國家自然科學基金（41473004）、國家自然科學青年基金（41301553）

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