microRNA-26a在原發性肝癌患者中的表達及臨床意義研究

杜磊 苗成龍 馮方棟

microRNA-26a在原發性肝癌患者中的表達及臨床意義研究

杜磊 苗成龍 馮方棟

目的 探討microRNA-26a在原發性肝癌（HCC）患者中的表達及臨床意義。方法 選取HCC、慢性乙型肝炎（CH）患者各28例。HCC患者留取癌組織、癌旁組織、血漿標本，CH患者留取血漿標本，采用RT-PCR法檢測標本microRNA-26a的表達水平。比較HCC患者與CH患者microRNA-26a表達水平；分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平的相關性；比較血漿microRNA-26a與血清甲胎蛋白（AFP）診斷HCC的靈敏度、特異度；以血漿microRNA-26a水平最佳臨界值（2.873）為界，將HCC患者分為microRNA-26a高表達組和低表達組，比較兩組患者術后1年生存率。結果 HCC患者血漿microRNA-26a表達水平低于CH患者（P＜0.05）。HCC患者癌組織microRNA-26a表達水平低于癌旁組織（P＜0.05）。HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平呈正相關（r=0.574，P＜0.038）。血漿microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強（85.8%vs 57.8%，P＜0.05），但特異度較血清AFP弱（65.2%vs 80.52%，P＜0.05）。microRNA-26a高表達組患者術后1年生存率高于低表達組（60.25%vs 45.77%，P＜0.05）。結論 HCC患者microRNA-26a表達水平較低，microRNA-26a可作為早期診斷HCC的生物標志物，也可作為HCC患者預后評估指標。

原發性肝癌 microRNA-26a 甲胎蛋白 相關性 生存曲線

肝細胞癌是原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，HCC）的主要類型，占HCC的70%～85%，是常見的惡性腫瘤之一。我國每年約有40萬HCC新增病例[1]，HBV感染導致肝硬化進而發展成HCC是其發病率逐年上升的主要原因[2]。HCC具有惡性程度、發病率、病死亡率高，治愈率低的特點，早期不易診斷，多數患者首診時已發展至中晚期，失去了接受根治性手術治療的機會[3]。甲胎蛋白（AFP）作為一種血清學生物標志物用于早期HCC的臨床診斷和預測，但其靈敏度和特異度偏低。因此，尋找新型生物標志物用于早期HCC診斷迫在眉睫[4]。microRNA是一類含有19～25 bp的非編碼單鏈小RNA分子，其在生物體的發育，細胞增殖、分化和凋亡等過程中發揮重要作用[5]。microRNA異常表達與腫瘤發生、發展密切相關，且不同疾病狀態下microRNA表達存在明顯差異，這提示microRNA或可作為生物標志物用于惡性腫瘤的診斷和預后評估[6-7]。研究發現，microRNA-26a在肝癌組織中的表達低于癌旁組織[8]，提示其或可作為HCC臨床診斷潛在的生物標志物。本研究通過檢測microRNA-26a在HCC組織和血漿中的表達水平，探討其作為生物標志物用于HCC臨床診斷和預后評估的意義，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年1月至2016年1月本院普外科收治的HCC患者28例。納入標準：（1）由乙型肝炎導致肝硬化進而發展成HCC的患者；（2）NCCN臨床實踐指南[9]規定的可接受根治性手術治療的HCC患者；（3）組織病理學診斷為HCC的患者；（4）術后存活1年以上的HCC患者。另同期擇與HCC患者性別、年齡相近的慢性乙型肝炎（CH）患者28例作為對照，入組的CH患者均無重大疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料采集 使用Epidata 3.0軟件建立病歷數據庫，項目包括患者人口統計學特征、腫瘤生物學行為、實驗室及影像學檢查結果、腫瘤臨床分期及手術情況。

1.2.2 標本留取 HCC患者留取癌組織、癌旁組織、血漿標本，CH患者留取血漿標本，均保存于本院中心實驗室-80°C環境中。

1.2.3 HCC患者與CH患者microRNA-26a表達檢測應用RT-PCR法，檢測工作由武漢康圣達醫學檢驗所統一于2016年8至10月完成。按照miRNeasy Mini試劑盒（德國QIAGEN公司）說明書提取HCC患者癌組織、癌旁組織總RNA；按照BLOODmisi試劑盒（中國Aidlab公司）說明書提取HCC患者、CH患者血漿標本總RNA；按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應條件為 37°C，1h，合成的cDNA置于-80°C保存。取2ng cDNA進行RT-PCR反應，反應條件：95°C預變性5min；95°C，30s；60°C，30s；72°C，35s，40 個循環；72°C，10min。采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TM RTPCR Detection System（美國Bio-rad公司）進行數據分析，結果經U6RNA內參校正，microRNA-26a相對表達水平用2-ΔΔCt表示，進行3次獨立重復實驗。

1.2.4 血漿microRNA-26a和血清AFP的診斷效能分析 運用ROC曲線及AUC評價血漿microRNA-26a和血清AFP診斷HCC的能力，得出microRNA-26a作為診斷HCC生物標志物的最佳臨界值。

1.2.5 HCC患者短期生存分析 以最佳臨界值為界，根據HCC患者血漿microRNA-26a水平分為microRNA-26a高表達組和低表達組，比較兩組患者術后1年生存率。

1.3 觀察指標 比較HCC患者與CH患者的臨床資料；比較HCC患者與CH患者microRNA-26a表達水平；分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平的相關性；比較血漿microRNA-26a與血清AFP診斷HCC的靈敏度、特異度；比較microRNA-26a高表達組和低表達組患者術后1年生存率。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，兩組比較采用χ2檢驗；采用直線相關分析HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平的關系；采用Kaplan-Meier法估計兩組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者與CH患者臨床資料比較 見表1。

表1 HCC患者與CH患者臨床資料比較

由表1可見，HCC患者與CH患者性別、年齡、RBC、WBC、PLT、Hb、ALT、AST、谷氨酰轉肽酶、堿性磷酸酶、TBil及肝功能 Child-Pugh分級等比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；HCC患者AFP水平高于HC患者（P＜0.05）。

2.2 HCC患者與CH患者microRNA-26a表達水平比較 HCC患者癌組織、癌旁組織的microRNA-26a表達水平分別為 0.420±0.02、1.325±0.03，癌組織低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。 HCC患者、CH患者血漿microRNA-26a表達水平分別為0.893±0.01、4.125±0.14，HCC患者低于CH患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平的相關性分析 見圖1。

圖1 28例HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平的相關性

由圖1可見，HCC患者癌組織、癌旁組織microRNA-26a表達水平呈正相關（r=0.574，P＜0.038）。

2.4 血漿microRNA-26a與血清AFP診斷HCC效能比較 見圖2。

圖2 血漿microRNA-26a和血清AFP診斷HCC的ROC曲線

由圖2可見，當血漿microRNA-26a臨界值為2.873 時，AUC 最大值為 0.725（95%CI：0.608～0.912，P＜0.05），此時microRNA-26a診斷HCC的靈敏度和特異度分別為85.8%、65.2%。當血清AFP臨界值為20.42ng/ml時，AUC 最大值為 0.610（95%CI：0.615～0.833，P＜0.05），此時AFP診斷HCC的靈敏度和特異度分別為57.8%、80.52%。這提示血漿microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強，但特異度較血清AFP弱。

2.5 microRNA-26a高表達組和低表達組患者術后生存率比較 見圖3。

圖3 microRNA-26a高表達組和低表達組患者術后生存曲線

由圖3可見，microRNA-26a高表達組和低表達組患者術后1年生存率分別為60.25%、45.77%，高表達組患者生存率高于低表達組（P＜0.05）。

3 討論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，好發于40～50歲人群，男性發病率高于女性。目前臨床尚無有效治療HCC的靶向藥物以及優等的早期診斷HCC生物標志物，AFP是臨床上用于診斷HCC的常用生物標志物，但其靈敏度和特異度偏低（分別為40%～65%、76%～90%），易導致假陽性或假陰性結果[4,10]。早期診斷是影響HCC預后和生存的關鍵因素，因此尋找新型的高效腫瘤標志物用于HCC的早期診斷和預后判斷已成為迫切需要解決的問題。

microRNA在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用，其表達譜與腫瘤類型相關，不同種類的腫瘤具有不同的表達模式[5]，提示microRNA可作為腫瘤疾病的生物標志物用于腫瘤診斷、預后判斷[11]。本研究對28例HCC患者的癌組織、癌旁組織，HCC患者和CH患者血漿樣本進行microRNA-26a檢測，發現HCC患者癌組織中microRNA-26a表達水平低于癌旁組織，HCC患者血漿中的microRNA-26a表達水平低于CH患者，這提示microRNA-26可作為早期診斷HCC潛在的標志物。本研究結果顯示，HCC患者血清 AFP水平明顯高于CH患者，同時發現microRNA-26a診斷HCC的靈敏度較血清AFP強，但特異度較血清AFP弱。

研究發現，microRNA-26a可作為大腸癌[12]和乳腺癌[13]患者預后評估指標；在HCC中的研究以現，microRNA-26a可通過HGF-cMet抑制腫瘤血管重建，是一種潛在的治療靶標[8，14]。生存曲線結果顯示microRNA-26a高表達組患者術后1年生存率高于低表達組患者，這提示microRNA-26a作為一種抑癌基因在HCC發生、發展中發揮重要作用。

綜上所述，本研究結果顯示HCC患者microRNA-26a表達水平較低，microRNA-26a可作為早期診斷HCC的生物標志物，也可作為HCC患者預后評估指標，但其生物學功能尚待進一步深入研究。

[1] JemalA,Bray F,Center M M,et al.Globalcancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Kudo M.Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma:basics and ongoing clinical trials[J].Oncology,2017,92(1):50-62.

[3] Kirstein M M,VogelA.Epidemiology and Risk Factors of Cholangiocarcinoma[J].Visc Med,2016,32(6):395-400.

[4] Kondo Y,Kimura O,Shimosegawa.Significant biomarkers for the management of hepatocellular carcinoma[J].Clin J Gastroenterol,2015,8(3):109-115.

[5] Zhou L,Liu F,Wang X,et al.The roles of microRNAs in the regulation of tumor metastasis[J].CellBiosci,2015,5(1):32-35.

[6] Budhu A,Jia H L,Forgues M,et al.Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,47(3):897-907.

[7]Lu M,Kong X,Wang H,et al.A novel microRNAs expression signature for hepatocellular carcinoma diagnosis and prognosis[J].Oncotarget,2017,8(5):8775-8784.

[8] Yang X,Zhang X F,Lu X,et al.MicroRNA-26a suppresses angiogenesisin human hepatocellular carcinoma by targeting HGF-cmet pathway[J].Hepatology,2013,18(26):147-154.

[9] Benson A R,Abrams T A,Ben-Josef E,et al.NCCN clinical practice guidelines in oncology:hepatobiliary cancers[J].J Natl Compr Canc Netw,2009,7(4):350-391.

[10] Bertino G,Ardiri A,Malaguarnera M,et al.Hepatocellualar carcinoma serum markers[J].Semin Oncol,2012,39(4):410-433.

[11] Piao Y,Piao M,Ryu K H.Multiclass cancer classification using a feature subset-based ensemble from microRNA expression profiles[J].Comput BiolMed,2017,80(1):39-44.

[12] Chen D L,Wang Z Q,Zeng Z L,et al.Identification of miR-214 as a negative regulator of colorectal cancer liver metastasis via regulation of FGFR1 expression[J].Hepatology,2014,60(2):598-609.

[13] Bojmar L,Karlsson E,Ellegard S,et al.The role of microRNA-200 in progression of human colorectal and breast cancer[J].PLoS One,2013,8(12):e84815.

[14] Koberle V,Kronenberger B,Pleli T,et al.Serum microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma[J].Eur J Cancer,2013,49(16):3442-3449.

Expression of microRNA-26a in primary liver cancer and its clinical significance

DU Lei,MIAO Chenglong,FENG Fangdong.
Department of General Surgery,Pizhou People's Hospital of Jiangsu Province,Pizhou 221300,China

Objective To investigate the expression of microRNA-26a (mRNA-26a)in primary hepatocellular carcinoma(HCC)and its clinical significance. Methods The expression of mRNA-26a were detected with RT-PCR in plasma,cancer tissue and pericancerous liver tissue samples from 28 patients with HCC and plasma samples from 28 patients with chronic hepatitis B(CHB).The clinical significance of mRNA-26a expression in HCC was analyzed. Results The expression level of plasma microRNA-26a in HCC patients was lower than that in CHB patients(P＜0.05).The expression level of microRNA-26a in cancer tissues of HCC patients was lower than that of pericancerous liver tissues(P＜0.05).There was a positive correlation between the expression of microRNA-26a in cancer tissues and pericancerous liver tissues(r=0.574,P＜0.05).The sensitivity of plasma microRNA-26a in diagnosis of HCC was higher than that in serum AFP(85.8%vs 57.8%,P＜0.05),but the specificity was lower than that of serum AFP(65.2%vs 80.52%,P＜0.05).The 1-year survival rate of patients with high expression of mRNA-26a was higher than that of low expression group(60.25%vs 45.77%,P＜0.05). Conclusion The expression level of mRNA-26a in HCC tissues is down-regulated,it may be used as a molecular marker for early diagnosis of HCC.

Primary hepatocellular carcinoma MicroRNA-26a Alpha-fetoprotein Correlation Survival curve

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-542

221300 江蘇省邳州市人民醫院普外科

馮方棟，E-mail：ffd2013hb@163.com

2017-03-13）

李媚）