3型酸敏感離子通道在髓核致炎大鼠背根神經節中的表達研究

林士明 陳亦鵬 潘浩 王棟 賈高永 胡慶豐

3型酸敏感離子通道在髓核致炎大鼠背根神經節中的表達研究

林士明 陳亦鵬 潘浩 王棟 賈高永 胡慶豐

目的 通過觀察3型酸敏感離子通道（ASIC3）信號通路阻斷劑阿米洛利對髓核致炎大鼠背根神經節（DRG）中ASIC3表達的影響，探索ASIC3在髓核組織誘導發生根性疼痛過程中的可能機制。方法 48只大鼠采用隨機數字表法分為對照組、模型組和阿米洛利組3組，每組16只。對照組在暴露L5DRG后直接縫合。模型組取出大鼠尾部的髓核組織置于暴露的L5DRG上，縫合切口。阿米洛利組在模型組的基礎上，于術后2周內每天腹腔內注射20μg/kg阿米洛利。對照組和模型組不進行藥物干預。造模成功后分別于術后2、4、6、8、10、12d檢測大鼠后足的機械刺激縮足閾值（PWT）。采用RT-PCR法和Western blot法測定ASIC3、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達水平。術后1、3、7和14d采用ELISA法檢測外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平，并檢測一氧化氮（NO）水平。結果 與對照組比較，術后12d時模型組大鼠后足的PWT顯著下降（P＜0.01），術后14d模型組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平上調（均P＜0.01），外周血和DRG中NO、TNF-α、IL-6水平均上調（均P＜0.01）。與模型組比較，阿米洛利組大鼠后足的PWT在8d內下降，之后逐漸增加，術后10和12d大鼠后足的PWT明顯高于模型組（均P＜0.01），術后14d DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平下降（均P＜0.05），外周血和DRG中NO、TNF-α、IL-6水平均顯著降低（均P＜0.01）。結論ASIC3可能在由髓核突出引起的神經根性疼痛中起重要作用。ASIC3可能通過上調NO及細胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表達并增強這些介質的疼痛加強作用，誘導痛覺過敏從而引起神經根性疼痛。

椎間盤 髓核 3型酸敏感離子通道 炎癥

椎間盤突出后引起的根性疼痛與髓核致炎背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）的受壓和髓核接觸神經根后誘導的炎性反應及自身免疫過程有關。椎間盤突出后，髓核組織分泌的促炎細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8水平增加[1-3]。此外，免疫球蛋白、氫、一氧化氮（NO）和磷脂酶A2也參與到椎間盤疾患的病理生理反應[4]。髓核與神經根接觸后誘導的炎癥反應是復雜的，各種細胞介質和炎癥通路參與其中。酸敏感離子通道（acid sensing ion channel，ASIC）蛋白是阿米洛利敏感性Na+通道/變性蛋白家族的成員，其形成同聚和異聚功能膜通道[5]，其中ASIC3已被證實與缺血、炎癥或組織酸中毒相關疼痛的傳導緊密相關，使髓核適應椎間盤的酸性和高滲生物龕。本研究擬觀察ASIC3信號通路阻斷劑阿米洛利對髓核致炎大鼠DRG中ASIC3表達的影響，并檢測大鼠后足機械刺激縮足閾值（pain withdrawal threshold，PWT） 及外周血和 DRG中 NO、TNF-α、IL-6水平，以探索ASIC3在髓核組織誘導發生根性疼痛過程中的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物條件 48只清潔級成年雄性SD大鼠，體重220～240g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXY（浙）2013-0016。實驗在浙江中醫藥大學實驗動物中心進行，實驗室溫度22～25℃、12h明暗循環，大鼠自由飲水攝食。實驗程序遵循美國國立衛生研究院制定的《實驗動物護理和使用指南》（第9版，2010年）。動物實驗方案通過浙江中醫藥大學醫學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 手術方法 通過腹腔內注射水合氯醛（100g/L）麻醉大鼠。以大鼠髂嵴最高點連線為中心作25～30mm正中縱切口暴露脊柱及兩側組織，切除L5下關節突、L6上關節突和L5半椎板，暴露左側L5DRG及部分脊髓硬膜囊。采用18G的皮膚穿刺針頭在L5～6椎間盤進行穿刺，針頭用持針器夾持，尖端保留5mm長度，于纖維環前外側方平行終板方向刺入，深度控制在5mm，刺入后維持5s；然后，斷尾，縱向切開鼠尾根部，從2個椎間盤內取髓核組織共0.4mg，置于L5DRG上，術畢逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。術后肌肉注射2萬U青霉素（80萬U/0.48g，H37021359，齊魯制藥有限公司）預防感染。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 48只大鼠采用隨機數字表法分為對照組、模型組和阿米洛利組3組，每組16只。各組處理及給藥方法如下：（1）對照組在上述手術過程中暴露L5DRG后直接縫合。（2）模型組按上述手術方法進行造模。（3）阿米洛利組：按上述手術方法進行造模，并于術后2周內每天腹腔內注射20μg/kg阿米洛利（H10900015，美國Sigma公司）。對照組和模型組不進行藥物干預。術后1、3、7、14d，每天隨機處死3只大鼠并取出L5DRG，采用5ml注射器刺入L5～6椎間隙水平內取外周血，-20℃保存。

1.2.3 大鼠后足的PWT測定 各組隨機選取4只大鼠分別于術后 2、4、6、8、10、12d 采用 Up-Down 法測定大鼠后足的PWT。檢測工具為8根強度呈對數遞增方式的Von Frey纖毛機械刺激針（BIO-EVF3，上海玉研科學儀器有限公司），間隔5min重復刺激3次，初始刺激強度為2.04g，每次刺激時間為4～6s。在測試前30min，將大鼠置于測定PWT值用的籠子內適應測試環境。

1.2.4 ASIC3、TNF-α和 IL-6 mRNA表達水平測定采用RT-PCR法。術后14d，以Trizol法提取L5DRG中總RNA。取1μg總RNA進行逆轉錄。逆轉錄條件：37℃60min，85℃ 5min，4℃ 5min。以 GAPDH 為內參，設計引物：ASIC3 上游為 5′-CGCTATGTGGCTCGGAAGTG-3′，下游為 5′-TGTAGGACTCGCTGCGGTTG-3′；TNF-α 上游為 5′-CTGAGGTCAACCTGCCCAAG-3′，下游為 5′-GGCTGGGTAGAGAACGGATG-3′；IL-6 上游為 5′-CACCAGGAACGAAAGTCAAC-3′，下游為 5′-GGCTGTCAACAACATCAGTC-3′。通過逆轉錄合成的cDNA 2μl進行RT-PCR擴增。RT-PCR反應條件為：95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s循環擴增。采用ABI Prism 7300 SDS（美國ABI公司）儀器分析數據。

1.2.5 ASIC3、TNF-α和IL-6蛋白表達水平測定 采用Western blot法。術后14d，將DRG剪成細小的碎片，按每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000g離心15min，取上清液，進行蛋白含量測定。蛋白含量采用紫外分光光度法在562nm處進行濃度測定。灌膠上樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳后，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用立春紅染色觀察轉印是是否成功，5%脫脂奶粉的Tris緩沖液4℃過夜封閉，洗膜后分別加入兔抗鼠 ASIC3（1∶400）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）一抗溶液，4℃雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1 000稀釋的二抗雜交 1h后，取出用洗膜液沖洗，ECL顯色，并使用Image J.1.46軟件分析灰度值。

1.2.6 TNF-α和IL-6水平測定 采用ELISA法測定術后1、3、7、14d外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平。試劑盒由上海恒斐生物科技有限公司提供。

1.2.7 NO水平檢測 將外周血和DRG以1 000g離心10min，收集上清液，使用NO測定試劑盒（型號A012，南京建成生物工程研究所）在術后1、3、7和14d測定NO水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達水平比較 模型組及阿米洛利組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平均高于對照組（均P＜0.01），而阿米洛利組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達水平均低于模型組（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達水平比較（a：3組大鼠ASIC3的mRNA表達水平比較；b：3組大鼠ASIC3蛋白表達電泳圖；c：3組大鼠ASIC3的蛋白表達水平比較）

2.2 大鼠后足 PWT的變化情況 術后 2、4、6、8、10、12d模型組大鼠后足的PWT與對照組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。阿米洛利組大鼠后足的PWT在術后8d內下降，之后逐漸增加；術后10和12d大鼠后足的PWT明顯高于模型組，差異均有統計學意義（均 P＜0.01），見圖 2。

2.3 3組大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表達水平的比較 模型組及阿米洛利組大鼠外周血和DRG 中術后 1、3、7、14d 的 NO、TNF-α 和 IL-6表達水平較對照組顯著上調（均P＜0.05），且模型組術后3、7、14d的NO、TNF-α和IL-6表達水平較阿米洛利組也顯著上調（均P＜0.01），見表1～3。通過RT-PCR法和Western blot法測量3組大鼠DRG也發現類似的結果，見圖3。

圖2 大鼠后足PWT的變化情況

表1 3組大鼠外周血和DRG中NO表達水平的比較（μmol/L）

3 討論

椎間盤突出引起的椎神經根病與DRG損傷密切相關。大量的證據表明ASIC3可能涉及椎神經根病的各種因素和各種類型的疼痛，例如缺血性、炎性、機械性和神經根性疼痛[6-8]。然而，ASIC3信號通路阻斷劑在椎神經根病中的作用還是未知的。本研究中，筆者加入了ASIC3信號通路阻斷劑阿米洛利，從而進一步探討ASIC3在椎間盤突出引起的神經根性疼痛的作用機制。椎間盤是含髓核組織的特殊生物力學結構，通過分泌基質高分子，提高滲透壓來使其適應所施加的機械負荷。最近一些研究把焦點轉移到由髓核組織與神經根和周圍組織接觸引發的炎癥過程[9-10]。髓核被認為是有限的血管供應的閉合組織，椎間盤纖維環破裂后，髓核通過裂隙突出椎管內，此時髓核作為一個特異性抗原，將導致自身免疫反應發生，通過釋放各種細胞炎性介質引起一系列炎癥反應[11-12]。本研究通過將髓核置于DRG的模型組與未將髓核置于DRG的對照組比較，發現模型組DRG神經元中ASIC3的mRNA和蛋白表達水平顯著增加，表明細胞炎癥反應可以引起ASIC3在DRG神經元的上調，而腹腔內注射阿米洛利則顯著抑制了DRG神經元中ASIC3表達的增加。

表2 3組大鼠外周血和DRG中TNF-α表達水平的比較（ng/L）

表3 3組大鼠外周血和DRG中IL-6表達水平的比較（ng/L）

圖3 3組大鼠DRG中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平比較（a：3組大鼠IL-6和TNF-α的mRNA表達水平比較；b：3組大鼠IL-6和TNF-α蛋白表達電泳圖；c：3組大鼠IL-6和TNF-α的蛋白表達水平比較）

痛覺過敏是所有炎癥過程的共同特征，其特征性在于感受傷害閾值的降低和對于熱和機械刺激的敏感增加[13]。本研究模型組中大鼠后足的PWT在術后12d內持續下降，在10d時下降最為明顯。然而，由髓核組織誘導的痛覺過敏在阿米洛利組中得到顯著改善，在術后8d開始顯著上升。表明ASIC3與痛覺過敏密切相關，阿米洛利可減輕ASIC3介導的痛覺過敏。

NO和細胞炎性因子（TNF-α和IL-6）與神經肽的增加相關，在先前研究中觀察到，用細胞炎性因子抑制劑阻斷其上游信號通路可以減少外周和中樞神經系統疼痛[14-15]。本研究模型組術后14d，通過ELISA和生化檢測到外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6水平均增加。通過Western blot法也同樣檢測到DRG中TNF-α和IL-6水平均增加。阿米洛利組顯著抑制了術后3、7、14d NO、TNF-α和IL-6水平的上調。表明ASIC3與炎癥過程密切相關，可以促進多種炎性因子的表達并增強這些介質的疼痛加強作用。而阿米洛利通過抑制ASIC3的表達從而降低細胞炎性因子的表達，減緩局部的炎癥反應。

綜上所述，椎間盤突出發生后，髓核介導的炎癥反應可以引起ASIC3在DRG神經元上的表達上調，而ASIC3又可促進多種細胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表達，使局部形成正反饋，加強這些介質的疼痛加強作用，誘導痛覺過敏從而引起神經根性疼痛。抑制ASIC3則可以減弱髓核組織對DRG的炎癥損傷而致的痛覺過敏，減緩神經根性疼痛。

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Effect of amiloride on ASIC3 expression in dorsal root ganglion following nerve root inflammation induced by nucleus pulposus in rats

LIN Shiming,CHEN Yipeng,PAN Hao，et al.
Department of Orthopedics，Guang Xing Hospital Affliated to Zhejiang Uniuersity of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，China

Objective To investigate the effect of amiloride on the expression of acid sensing ion channel 3 (ASIC3)in dorsal root ganglion(DRG)following nerve root inflammation induced by nucleus pulposus in rats. Methods Forty eight SD rats were randomly divided into control group(Sham,n=16),inflammation group(NP,n=16),inflammation+amiloride group(NP+Ami,n=16).The L5DRG was exposed in rats of NP and NP+Ami groups by surgery,and sham surgery was performed in sham group.Intraperitoneal injection of amiloride 20μg/kg was given to rats in NP+Ami group q.d for 2 weeks after surgery,and no amiloride was given to rats in sham group and NP group．The mechanical pain withdrawal threshold(PWT)was evaluated at 2,4,6,8,10 and 12d after modeling.The expression of ASIC3,TNF-α,IL-6 mRNA and protein were examined by Real-time PCR and Western blot,respectively.TNF-α and IL-6 concentrations present in peripheral blood and DRG were determined at 1,3,7 and 14d after the surgical procedures using ELISA method.NO levels were examined by biochemistry test. Results Rats exposed to the NP showed decreased PWT at 12d after surgery(P＜0.01),and the levels of ASIC3 and the NO,TNF-α,IL-6 were up-regulated in DRG induced by NP 14d after surgery(all P＜0.01).Compared to NP group the mechanical PWT decreased at 8d after surgery and then gradually increased at 10 and 12d after surgery in NP+Ami group (all P＜0.01).ASIC3 was down-regulated(both P＜0.05),and the levels of NO,TNF-α,IL-6 were significantly decreased at 14d after surgery(all P＜0.01)in NP+Ami group. Conclusion ASIC3 may upgrade the expression of NO and inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 to induce hyperalgesia and never root pain.

Intervertebral disc Nucleus pulposus ASIC3 Inflammation

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-918

浙江省中醫藥科技計劃項目（2015ZA157）；杭州市科技計劃重點項目（20150733Q60）

310007 杭州，浙江中醫藥大學附屬廣興醫院骨科

胡慶豐，E-mail：huqingfeng258@163.com

2017-04-22）

陳麗）