腦梗死并阿司匹林抵抗患者血漿miRNA155和IL-6水平變化及相關性研究

劉娜 周志奎 劉愛華

腦梗死并阿司匹林抵抗患者血漿miRNA155和IL-6水平變化及相關性研究

劉娜 周志奎 劉愛華

目的探討急性腦梗死并阿司匹林抵抗患者血漿miRNA155、白介素-6 (IL-6)水平變化及相關性。方法選擇220例急性腦梗死患者，通過血小板聚集實驗區分阿司匹林抵抗組(AR組)和非阿司匹林抵抗組(NAR組)，對比分析2組基礎資料、microRNA155、血漿IL-6水平變化以及2組血漿miRNA155與IL-6水平的相關性。結果2組患者基礎資料比較無明顯差別(P均>0.05)；AR組患者miRNA155、IL-6水平顯著高于NAR組(P均<0.05)；血漿miRNA155 與IL-6水平呈顯著正相關(r=0.82，P<0.05)。結論AR組患者血漿miRNA155、IL-6水平顯著升高,這在一定程度上提示腦梗死患者阿司匹林抵抗的發生。

急性腦梗死 阿司匹林抵抗 miRNA155 IL-6

腦血管病是危害中老年人身體健康和生命的主要疾病之一，由于其較高患病率、致殘率、病死率給社會、家庭帶來沉重的負擔。因此，腦卒中的預防成為近年來的熱門話題。美國卒中學會和我國腦梗死治療的專家共識中阿司匹林是重要的一線治療及二線預防用藥，但是人們發現部分應用阿司匹林的患者仍不能有效地抑制血小板聚集和活化，從而導致缺血事件的復發率升高，這種現象即阿司匹林抵抗(AR)。

阿司匹林抵抗的發生機制復雜，至今尚未完全明了，主要包括(1)用藥劑量與阿司匹林抵抗的關系；(2)COX-2的可能作用；(3)基因多態性；(4)與藥物間的相互作用有關等[1]。目前的熱點為微小RNA (miRNA)的相關研究。miRNA可通過作用于靶mRNA進而調節靶蛋白的表達，從而在機體正常生理及病理過程中發揮著重要作用[2]。本實驗通過觀察血小板中miRNA155表達水平對AR的影響，旨在探討其在阿司匹林抵抗中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇急性腦梗死患者220例，均為2015年06月～2016年6月神經內科住院的急性腦梗死患者，其中男115例，女105例，年齡50～80歲，平均年齡(66.9±5.3)歲。所選患者符合以下入選標準：(1)診斷符合全國第四屆腦血管病學術會議第3次修訂的缺血性腦血管病診斷標準；(2)均為首次急性發病；(3)無嚴重心肺疾病和肝腎功能不全、腫瘤、結締組織病、自身免疫性疾病及其他腦部器質性病變；(4)簽署知情同意書者。排除標準:(1)合并感染、高熱及自身免疫疾病者; (2)精神疾病者; (3)合并哮喘、腫瘤、HIV 病毒感染者；(4)在入選前長期服用阿司匹林、氯吡格雷、非甾體抗炎藥等影響血小板活性的藥物。

1.2 方法

1.2.1 一般資料

記錄并檢測所有研究對象的基本資料,包括年齡、性別、體質量指數(BMI)、吸煙例數、舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)、甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷氨酸轉氨酶(ALT)及血漿中IL-6水平。

1.2.2 血小板聚集率測定

把從靜脈中取得的血液以1000 r/min離心8 min，離心半徑15 cm，取上層PRP，計數血小板；剩余血液以3000 r/min離心10 min，取出血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，用PPP調整PRP中的血小板數；將PRP及PPP各225 μL分別加入兩支反應杯中，加攪拌棒，于37 ℃溫浴5 min；將聚集劑AA和ADP加入樣本中，使其終濃度分別為0.5 mg /mL和10 μmol/L；數據用聚集百分率和斜率表示。分別測量對照組體外PRP給予阿司匹林(終濃度為330 μmol/L，室溫孵育30 min)前后的聚集率。根據 GUM標準，靜脈血加入阿司匹林處理后ADP誘導的血小板聚集率≥70%或 AA 誘導的血小板聚集率≥20%的標本即為 AR，反之為NAR。

1.2.3 血漿中miRNA155表達水平的檢測

取樣本200 μL血漿,加入5 μL作為內參的50 pmol/L的線蟲mi-39(Qiagen公司),再加入5 moL/L醋酸20 μL和750 μL TRI RegentBD(Molecular Research Center ),按TRI Regent BD說明書提取RNA；取2 μLRNA用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒(Applied Biosystems公司)獲取eDNA,反應條件:16 ℃ 30 min, 42 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 min, 40 ℃維持；取2 μL cDNA作為模板,用TaqMan Universal Master Mix 11試劑盒進行RT-PCR, miR155和miR39 探針為Taq Man公司提供；PCR條件:95 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s，50個循環；每份標本設3個復孔；采用ABI 9700實時定量PCR儀進行檢測,用SDS2.1軟件計算標本Ct值，檢測miRNA155表達水平。

1.2.4 統計學處理

2 結 果

2.1 AR發生率

220例患者中共出現56例阿司匹林抵抗，AR發生率為25.5%；非阿司匹林抵抗的患者共164例，發生率為74.5%。

2.2 一般資料比較

阿司匹林抵抗組與非阿司匹林抵抗組比較，年齡、性別、BMI、吸煙例數、TG、TC、LDL-C、Cr、BUN、ALT等基礎指標組間比較均不具有統計學差異(P均>0.05)(表1)。

2.3 各組血漿IL-6、miRNA155水平比較

AR組IL-6表達水平較NAR組升高(P<0.05)；AR組與NAR組比較，miRNA155水平顯著升高(P<0.01)(表2)。

表1 各組一般資料比較

表2 各組血漿IL-6、miRNA155 水平比較)

3 討 論

阿司匹林是缺血性腦血管疾病的首選預防用藥，但Floyd等研究認為阿司匹林抵抗在固定人群中可以增加3倍以上的腦血管事件的發生概率[3]。目前關于阿司匹林抵抗的研究仍以COX1、COX2基因多態性為主，很少有關于miRNA的研究。本課題內容為腦梗死患者阿司匹林抵抗與miRNA關系的研究，實驗入選者均為江蘇鎮江漢族老年人。在入選人群中共發現阿司匹林抵抗者共56例，占總樣本的25.5%，非阿司匹林抵抗的患者共164例，占總樣本的74.5%。與國外近年來的報道相比，阿司匹林抵抗發生率為8%～45%相符[4-5]。

一些研究提示年齡、性別、吸煙、血紅蛋白水平、高脂血癥等影響阿司匹林聚集情況，本實驗AR組及NAR組的基礎資料差別不大，提示患者基礎資料對本實驗結果無明顯影響。因此，本研究認為不能下結論說這些眾所周知的危險因素是影響阿司匹林抵抗的原因，而是提示應該更積極地治療這些高危患者。

miRNA是約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，多數miRNA以堿基配對的方式結合到靶mRNA的3’非翻譯區后通過起始階段的翻譯抑制或其后mRNA的降解使基因表達沉默，從而達到調控基因表達的目的[6]。有些循環中的miRNA可作為糖尿病、冠心病的生物學指標。miRNA155在內皮細胞和血管平滑肌細胞中均有大量表達，其通過作用趨化因子和細胞因子等促炎介質上調，導致內皮細胞激活以及單核細胞進入血管壁且被激活[7-8]。有研究表明，降低miRNAl55的表達可以影響人涎腺腺樣囊性癌細胞中的表皮生長因子受體的表達和NF-κB信號通路[9]。NF-κB信號途徑是VEGF和COX2共有的一條信號傳導通路，此通路與炎癥和腫瘤的發生密切相關，miR155有可能通過對VEGF的調節進而影響著COX2的表達，從而表現出在AR和NAR之間的水平差異[10-11]。在炎癥環境下,小鼠巨噬細胞miRNA155的表達也明顯增高，改變miRNAl55的表達可以影響炎性細胞中的表達，炎性反應在動脈硬化及阿司匹林抵抗中的作用已得到共識，進一步提示miRNA155可能參與阿司匹林抵抗。

IL-6是一種主要由活化的單核巨噬細胞產生的糖蛋白,其在動脈粥樣硬化壁中的水平為血清水平的200倍，且可作用于血管壁而引起血管壁的損傷[12]。本實驗阿司匹林抵抗組較非阿司匹林抵抗組明顯升高，提示IL-6與阿司匹林抵抗有一定的關系。本研究還發現miRNA155與IL-6水平呈顯著正相關,提示兩者在阿司匹林抵抗反應方面有較好的一致性。有研究發現,在巨噬細胞中炎癥介質干擾素(IFNs)通過IL-6的自分泌/旁分泌激活可誘導miRNA155表達上調。本研究推測，一方面IL-6上調了miRNA155的表達；另一方面miRNA155的高表達促進趨化因子和細胞因子等促炎介質上調,兩者相互影響,相互促進,最終導致阿司匹林抵抗的發生。

綜上所述，本研究結果發現AR組血漿miRNA155水平顯著高于NAR組,提示血漿miRNA155可能對阿司匹林抵抗有預測價值。個體化抗血小板聚集治療是否有更好的成本效益比?相信隨著更多基礎研究和大規模隨機對照試驗的開展，這些問題最終都會得到答案，并進一步改善對阿司匹林抵抗的預防和治療。

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R743.32

A

1007-0478(2017)06-0534-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.06.014

鎮江市社會發展指導性項目(編號為FZ2015036)；江蘇大學醫學臨床科技發展基金項目(編號為JLY20160004)

212000 江蘇省鎮江市第一人民醫院(劉娜 周志奎)；江蘇省丹陽市人民醫院(劉愛華)

(2017-02-07收稿)