氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育及免疫毒性的研究

王榮春，何秋霞，韓建，陳錫強(qiáng)，孫晨，王希敏，韓利文，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育及免疫毒性的研究

王榮春，何秋霞，韓建，陳錫強(qiáng)，孫晨，王希敏，韓利文*，劉可春*

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

以野生型及轉(zhuǎn)基因Tg(lyz:EGFP)斑馬魚(yú)幼魚(yú)為研究對(duì)象，研究氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的發(fā)育毒性及對(duì)免疫細(xì)胞的影響。用不同濃度的氯霉素分別處理72 h，觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生存率、畸形率和形態(tài)變化，以及標(biāo)記綠色熒光免疫細(xì)胞在斑馬魚(yú)幼魚(yú)中的數(shù)量。結(jié)果顯示，隨著氯霉素濃度(≥ 100 mg/L)的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，斑馬魚(yú)的存活率和孵化率降低，死亡率升高；氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的致畸作用，主要表現(xiàn)為心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲；通過(guò)對(duì)Tg(lyz:EGFP)品系的觀察，發(fā)現(xiàn)氯霉素(≥ 75 mg/L)可以降低斑馬魚(yú)幼魚(yú)免疫細(xì)胞的數(shù)量。研究表明，氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的致畸和致死作用具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性，并可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)的免疫細(xì)胞數(shù)量減少，具有免疫毒性。

氯霉素；斑馬魚(yú)；發(fā)育毒性；免疫細(xì)胞

氯霉素(chloramphenicol)是一種廣譜抗生素，廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及臨床應(yīng)用中。氯霉素能夠抑制多種微生物的生長(zhǎng)，但在其應(yīng)用過(guò)程中也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，如骨髓抑制、白血病、再生不良性貧血等[1-3]。歐盟、美國(guó)及日本等國(guó)家已經(jīng)禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)中使用氯霉素，在我國(guó)雖然也已禁止，但由于其價(jià)格低廉且容易獲得，在生產(chǎn)、生活中仍有大量應(yīng)用。

斑馬魚(yú)是近年來(lái)藥物篩選和安全評(píng)價(jià)普遍使用的新型模式生物，在基因水平上與人類(lèi)具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于觀察、遺傳操作簡(jiǎn)單以及飼養(yǎng)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。同時(shí)，熒光標(biāo)記不同組織(肝臟、心臟、腎臟等)、細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)的多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系的出現(xiàn)，也促進(jìn)了斑馬魚(yú)在不同學(xué)科研究中的應(yīng)用[6-8]。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大、小鼠相比，斑馬魚(yú)具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、用藥量少、培養(yǎng)時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚(yú)作為一種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的模式動(dòng)物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的研究中[9-10]。

本研究以斑馬魚(yú)幼魚(yú)為動(dòng)物模型，探討了氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的發(fā)育毒性，并研究了氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)中心粒細(xì)胞發(fā)育及遷移的影響，為抗生素的毒理學(xué)研究提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 試劑

氯霉素(Sigma公司)使用DMSO(Sigma公司)配置，用斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水溶解稀釋。斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水的配方為:5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4[11]。三卡因( Sigma 公司) 使用純凈水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.16%的溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.3 儀器

體視熒光顯微鏡 SZX16(Olympus 公司)；斑馬魚(yú)飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 氯霉素與斑馬魚(yú)幼魚(yú)共孵育

將受精后1 h的野生型斑馬魚(yú)AB品系放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎于6孔板中，每孔30個(gè)胚胎。實(shí)驗(yàn)中氯霉素的濃度分別設(shè)置為0、25、50、75、100、150、200、300 mg /L(養(yǎng)殖水配置)和空白對(duì)照組(DMSO)，每孔給予不同濃度的氯霉素暴露液5 mL，每個(gè)濃度組分別設(shè)置 3個(gè)重復(fù)孔， 給藥后放在 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)。連續(xù)藥液暴露 3 d，每24 h更換一半藥液，并去除死亡幼魚(yú)。

2.2 斑馬魚(yú)幼魚(yú)觀察和記錄

分別在給藥24、48、72 h后記錄斑馬魚(yú)死亡數(shù)和畸形數(shù)，然后計(jì)算其死亡率、畸形率。使用三卡因麻醉幼魚(yú)后，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察，并記錄斑馬魚(yú)形態(tài)變化。

2.3 免疫細(xì)胞觀察

將受精后1 h的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(lyz:EGFP)品系進(jìn)行氯霉素處理(0、25、50、75、100、150 mg/L)，方法同2.1。

給藥72 h后，使用三卡因麻醉幼魚(yú)，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察綠色熒光標(biāo)記的中性粒細(xì)胞的數(shù)量和定位。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行樣本均數(shù)間多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率的影響

觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)的死亡情況，氯霉素暴露24 h后，空白對(duì)照組和氯霉素組(≤ 200 mg/L)在斑馬魚(yú)存活率上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，300 mg /L組斑馬魚(yú)存活率顯著下降；氯霉素暴露48 h后，隨著濃度的提高，氯霉素組(≥ 150 mg/L)存活率顯著性降低(P<0.05)；給藥72 h后，氯霉素組(≥ 100 mg/L)幼魚(yú)存活率顯著降低，300 mg/L處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)存活率低于5 %，見(jiàn)圖1。

*表示P<0.05,與對(duì)照相比具有顯著差異。圖1 氯霉素暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)存活率的影響Fig.1 The effect of chloramphenicol exposure on the survival rate of juvenile zebrafish

3.2 氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)孵化率和發(fā)育畸形的影響

氯霉素暴露72 h后，100、150、200、300 mg /L組斑馬魚(yú)孵化率顯著降低(P <0.05)，其中300 mg/L組孵化率接近0 %，見(jiàn)圖2。100、150、200、300 mg /L組斑馬魚(yú)畸形率顯著提高(P <0.05)，其中200、300 mg /L組畸形率為95%以上。畸形主要表現(xiàn)為心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲等癥狀，見(jiàn)圖3、4。

*表示P<0.05,與對(duì)照相比具有顯著差異。圖2 氯霉素暴露72 h對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響Fig.2 The effect of chloramphenicol exposure for 72 h on the hatching rate of zebrafish embryos

YSE 卵黃囊水腫； PE 心包水腫； SC 脊柱彎曲； CTL 對(duì)照。 圖3 氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育的影響Fig.3 The impact of chloramphenicol on the morphological development of the juvenile zebrafish

*表示P<0.05,與對(duì)照相比具有顯著差異。圖4 氯霉素暴露72 h對(duì)斑馬魚(yú)畸形率的影響Fig.4 The impact of chloramphenicol exposure for 72 h on the malformation rate of zebrafish

3.3 氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)中性粒細(xì)胞發(fā)育的影響

選取不同濃度的氯霉素(0、25、50、75、100、150 mg/L)處理綠色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(lyz:EGFP)品系胚胎。暴露72 h后，在體式熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)氯霉素可以抑制中性粒細(xì)胞的熒光表達(dá)，隨著氯霉素濃度升高，斑馬魚(yú)免疫細(xì)胞數(shù)目明顯減少。對(duì)斑馬魚(yú)尾部免疫細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，氯霉素暴露組(75、100 mg/L)斑馬魚(yú)幼魚(yú)尾部中性粒細(xì)胞的數(shù)目顯著降低，見(jiàn)圖5，6。

圖5 氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)免疫細(xì)胞發(fā)育的影響Fig.5 The effect of chloramphenicol on the immune cells development of juvenile zebrafish

*表示P<0.05,與對(duì)照相比具有顯著差異。圖6 AE氯霉素處理對(duì)斑馬魚(yú)免疫細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.6 The effect of chloramphenicol treatment on the immune cell number of zebrafish

4 討論

氯霉素從20世紀(jì)中葉被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在一段時(shí)期內(nèi)，作為人及動(dòng)物臨床治療疾病的藥物及飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，主要用于清除對(duì)機(jī)體造成不利影響的各類(lèi)病菌。然而，氯霉素在使用過(guò)程中表現(xiàn)出多種毒副作用，臨床表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨髓造血機(jī)能抑制、灰嬰綜合征、神經(jīng)毒性及免疫毒性等[12-14]。盡管抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性并對(duì)有機(jī)體產(chǎn)生危害，但是在一些缺乏對(duì)此類(lèi)藥物進(jìn)行管理控制的國(guó)家，仍然被大量使用。

斑馬魚(yú)胚胎及其幼魚(yú)用于研究藥物的發(fā)育毒性具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15-16]，多種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，可以在透明的魚(yú)體中直接觀察藥物對(duì)各類(lèi)組織及細(xì)胞的作用，更加有利于其在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度氯霉素暴露(25、50、75、100、150、200、300 mg /L)野生型AB品系斑馬魚(yú)，結(jié)果表明，氯霉素暴露24 h后，空白對(duì)照組和氯霉素組(≤ 200 mg/L)在斑馬魚(yú)存活率上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，300 mg /L組斑馬魚(yú)存活率顯著下降；氯霉素暴露48 h后，隨著濃度的提高，氯霉素組(≥ 150 mg/L)存活率顯著性降低(P>0.05)；給藥72 h后，氯霉素組(≥ 100 mg/L)幼魚(yú)存活率顯著降低，300 mg/L處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)存活率低于5 %。說(shuō)明氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)的發(fā)育具有毒性，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性。根據(jù)上述結(jié)果，我們選用25、50、75、100、150 mg /L的氯霉素處理免疫細(xì)胞標(biāo)記熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(lyz:EGFP)品系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露72 h后75、100 mg/L組斑馬魚(yú)免疫細(xì)胞數(shù)目明顯減少，而低濃度25、50 mg/L組，斑馬魚(yú)免疫細(xì)胞數(shù)目也明顯減少，說(shuō)明氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)具有免疫毒性。

本研究以斑馬魚(yú)幼魚(yú)為動(dòng)物模型，探討了氯霉素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的發(fā)育毒性，并利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在體直接觀察了氯霉素對(duì)免疫細(xì)胞的毒性影響，為進(jìn)一步闡述抗生素免疫毒性提供了重要模型。

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Researchontheeffectsofchloramphenicolondevelopmentalandimmunetoxicityofjuvenilezebrafish

WANGRong-chun，HEQiu-xia，HANJian，CHENXi-qiang，SUNChen，WANGXi-min，HANLi-wen*，LIUKe-chun*

(ShandongProvincialEngineeringLaboratoryforBiologicalTestingTechnology,KeyLaboratoryforDrugScreeningTechnologyofShandongAcademyofSciences,BiologyInstitute，ShandongAcademyofSciences,Jinan250301,China)

∶The impact of chloramphenicol on developmental toxicity and immune cells of wild and transgenic Tg(lyz:EGFP) juvenile zebrafish was investigated. After treated separately with different concentrations of chloramphenicol for 72 hours, the survival rate, abnormal rate, morphology variation of juvenile zebrafish, and the number of immune cells labeled with green fluorescent in juvenile zebrafish were observed. The results showed that with the increase of the concentration of chloramphenicol (≥100 mg/L) and the exposure time, the survival rate and hatching rate of zebrafish decreased, and mortality increased. The teratogenic effects of chloramphenicol on juvenile zebrafish included yolk sac edema, pericardial edema and spinal curvature. Through observation of the transgenic strain Tg(lyz:EGFP), it was found that chloramphenicol (≥75 mg/L) could inhibit the number of immune cells in zebrafish. This study showed that chloramphenicol had teratogenic and lethal effects on juvenile zebrafish in a time dependent and dose dependent manner. And chloramphenicol had immune toxicity, which could reduce the number of immune cells in juvenile zebrafish.

∶chloramphenicol；zebrafish；developmental toxicity；immune cell

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.006

2017-09-14

山東省科學(xué)院青年基金(2015QN010，2015QN012)；山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL009，ZR2015YL013)

王榮春(1983—)，男，博士，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。E-mail:1wangrongchun@163.com

*通信作者，韓利文(1980—)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選及代謝組學(xué)研究。E-mail: hanliwen08@126.com 劉可春(1964—)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。E-mail:hliukch@sdas.org

R737.33

A

1002-4026(2017)06-0035-06