正交試驗法優選黃芩配方顆粒的水提工藝

郝翠，穆巖，趙恒強，崔莉，劉偉，劉逢芹

(1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南250014；3. 山東省千佛山醫院，山東 濟南 250014)

正交試驗法優選黃芩配方顆粒的水提工藝

郝翠1,2，穆巖2，趙恒強2，崔莉2，劉偉2，劉逢芹3*

(1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南250014；3. 山東省千佛山醫院，山東 濟南 250014)

為優選黃芩配方顆粒制備過程中的水提取工藝，采用正交試驗法考察了加水量、提取次數和提取時間3個因素在不同水平對配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總含量和出膏率的影響，并進行了含量測定的方法學驗證。結果顯示，在本實驗條件下，影響成分總含量和出膏率的因素按程度大小依次為煎煮時間、煎煮次數、加水量，且不同煎煮時間具有顯著性差異(P<0.05)；經過驗證實驗，確定黃芩配方顆粒最佳水提工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。本研究優選的水提取工藝穩定可行，所得產品的有效成分含量和出膏率較高且較為穩定，可用于黃芩配方顆粒的制備。

正交試驗；黃芩配方顆粒；水提工藝

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]，藥用歷史悠久，主產于山東、河北、內蒙古等地，《神農本草經》將其列為中品，臨床常以單方或復方治療高血壓、冠心病等疾病[2-3]。研究表明，黃芩含黃酮類、酚苷、醇苷等化學成分，其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類成分為主要藥效成分，具有抑菌消炎、抗氧化和改善血液循環等多種藥理活性[4-6]。

中藥配方顆粒是由單味飲片經水提、濃縮、干燥、制粒而成的新型飲片形式，保留了傳統飲片的性味與歸經特性，具有起效時間短、劑量準確、便于攜帶等優點[7-8]。因此，配方顆粒的臨床用量近年來快速增長。目前文獻多集中于報道不同提取溶劑或先進技術(例如超高壓、超臨界等)對藥材提取率的影響。例如，有報道黃芩提取過程中，使用酶法、醇提等工藝大大高于溶劑水的提取率[9-11]，但近期公布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》[12]明確規定，配方顆粒提取過程須與湯劑相同，即限定為水提[13-14]，而目前對于黃芩配方顆粒制備的水提工藝的研究報道較少。故本實驗在傳統湯劑的基礎上，通過正交試驗法考察了加水量、提取次數和提取時間3個因素在不同水平對黃芩配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總量以及出膏率的影響，優選黃芩配方顆粒的提取工藝，使其更為接近臨床湯劑的應用實踐，避免過高提取率帶來的未知成分或不良反應，可為黃芩配方顆粒的制備和進一步研究提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1120高效液相色譜儀(包括Agilent DAD 檢測器，Agilent Chemstation工作站，美國Agilent)；BSA124S天平(德國Sartorius)；旋轉蒸發儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Scientz-10N冷凍干燥機(寧波新芝凍干設備股份有限公司)；GZX-9140 MBE數顯鼓風干燥干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；超聲波清洗機(SB-3200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(美國Fisher Scientific)；無水乙醇(北京益利精細化學品有限公司)；甲酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲酸銨(天津市科密歐化學試劑有限公司)；純凈水(娃哈哈集團有限公司)；黃芩苷對照品(批號 110715-201318，中國食品藥品檢定研究院)；漢黃芩苷(批號 MUST-13052312)、黃芩素(批號 MUST-13082206)、漢黃芩素(純度>98%批號 MUST-13092303，成都曼斯特生物科技有限公司)；黃芩飲片(批號 16011601，濟南禾寶中藥材有限公司)，經鑒定符合2015版《中國藥典》規定。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1 供試品溶液制備

取黃芩飲片100 g，加水10倍量，稱重，煎煮1 h，補足重量，過濾，濾渣再加水，重復煎煮3次，過濾，合并3次水提液，然后減壓濃縮至一定體積，凍干24 h后，粉碎過60目篩，乙醇制軟材，過20目篩后60 ℃烘干，過20目篩整粒后密封包裝，即黃芩配方顆粒。

精密稱取0.1 g配方顆粒，置圓底燒瓶中，加70%乙醇40 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，補至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻過濾，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液制備

分別精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對照品各5 mg，置50 mL量瓶中，分別用甲醇溶解，定容作為對照品儲備液，4 ℃冷藏，備用。分別精密吸取對照品貯備液適量，置10 mL量瓶中，定容，搖勻，即得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素濃度分別為30.0、12.0、1.5、0.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件

Wates-WAT054275色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A: 20 mmol·L-1甲酸銨的1%甲酸水溶液，流動相 B: 乙腈，洗脫方式(乙腈比例): 0～5 min，18%，5～8 min，18%～23%，8～18 min，23%～26%，18～50 min，40%～54%，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長274 nm，進樣量10 μL[15-16]。HPLC色譜圖見圖1。

1.黃芩苷； 2.漢黃芩苷； 3.黃芩素； 4.漢黃芩素。圖1 樣品及混合對照品的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of representative sample andmixed reference substances

2.1.4 線性關系考察

取2.1.2項下混合對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，配制成不同濃度對照品溶液，并按2.1.3項下色譜條件測定峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得如下回歸方程：黃芩苷回歸方程Y=8 478.4X+13.468(r=0.999 4)，線性范圍0.20～10 μg·mL-1；漢黃芩苷回歸方程Y=10 112X+101.97(r=0.999 6)，線性范圍0.10～10 μg·mL-1；黃芩素回歸方程Y=11 035X-5.1(r=0.999 3)，線性范圍0.10～10 μg·mL-1；漢黃芩素回歸方程Y=14 602X-0.402 8(r=0.999 9)，線性范圍0.20～10 μg·mL-1。結果表明，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素在標示濃度范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度實驗

取2.1.2項下混合對照品溶液，按2.1.3項下色譜條件進樣6次，測得峰面積相對標準偏差均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性實驗

取黃芩飲片適量，按照2.1.1項下方法制備6份供試品溶液，按2.1.3項下色譜條件進樣，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含有量的相對標準偏差均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性實驗

取2.1.1項下同一供試品溶液10 μL，分別在0，4，8，12，24 h進樣，測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積，計算相對標準偏差均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.8 加樣回收率實驗

取黃芩配方顆粒適量，共6份，每份加入各對照品溶液100%的量，按照2.1.1項下方法制備供試品溶液，在2.1.3項色譜條件下進樣測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的加樣回收率分別為93.32%、97.67%、95.16%和97.48%，相對標準偏差分別為3.08%、2.56%、4.23%和4.78%。結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.2 正交試驗設計

按照 L9(34) 正交設計[17]，以煎煮時間(A)、煎煮次數 (B)、加水量(C) 為影響因素，設計3個不同水平進行試驗考察。因素水平值見表2。

表2 因素水平表

稱取黃芩飲片100 g，共9份，按表2所示進行實驗，將提取液合并，然后減壓濃縮至一定體積，凍干24 h后，粉碎過60目篩，乙醇制軟材，過20目篩后60℃烘干，過20目篩整粒后密封包裝，即黃芩配方顆粒樣品。將樣品按照2.1項下方法制備供試品溶液，并以HPLC法進樣測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4個有效成分含量。

另取黃芩提取液10 mL置于干燥至恒重的蒸發皿中，在恒溫水浴鍋上蒸干后，于105 ℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量。按下式計算出膏率:

式中，m1為蒸發皿與干膏總質量；m2為蒸發皿質量；V1為提取液總體積；V2為取的提取液的體積；m為飲片質量。

以上述有效成分總量(總黃酮量)以及出膏率作為評價指標，考察不同因素水平對實驗結果的影響。具體結果見表3～4。

表3 正交試驗結果

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00； *表示顯著性差異。

2.3 正交試驗結果分析

正交試驗結果顯示，以總黃酮量和出膏率為指標，比較各考察因素的R值可知影響提取效率和出膏率的主要因素是煎煮時間，其次是煎煮次數和加水量。方差分析顯示，煎煮時間P<0.05，具有顯著差異，因此不同煎煮時間對活性成分的提取率和出膏率具有顯著影響。而在考察范圍內，不同加水量、煎煮次數P>0.05，此兩項因素影響相對較低，推測可能是由于黃酮類成分溶解度較高的原因。

綜合總黃酮量和出膏率兩個考察指標可知，在制備黃芩配方顆粒時，加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次，煎出總黃酮量和出膏率最高，是較適宜的提取條件。

2.4 驗證實驗

為進一步驗證正交試驗優選出的最佳提取工藝的準確性與重現性，故進行3批驗證實驗。分別稱取黃芩飲片3份，每份100 g，按優化所得工藝進行驗證實驗，并按上述方法考察總黃酮的含量及出膏率情況，結果見表5。

結果表明，在所選取的工藝條件下，總黃酮含量和出膏率較高，且相對穩定。故確定提取工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。

表5 驗證實驗結果

3 討論

目前，關于黃芩或其他中藥提取的文獻報道多集中于使用不同提取溶劑或先進技術(例如超高壓、超臨界等)提高藥材活性成分的提取率，但這與傳統湯劑的水提方式差異較大,容易造成未知不良反應，不適用于配方顆粒的提取工藝。另外，以往單一成分指標的測定不能準確反映中藥復雜體系的質量和藥效，因此，本研究采用接近煎煮湯劑形式的水提工藝為研究對象，通過正交試驗法研究了水提過程中的加水量、提取次數和提取時間3個因素在不同水平對黃芩配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總含量和出膏率的影響，并進行了含量測定的方法學驗證。

對正交試驗進行方差分析可知，各因素對總黃酮量和出膏率的影響程度為煎煮時間大于煎煮次數大于加水量，并且在此實驗條件下，煎煮時間具有顯著性差異(P<0.05)，加水量和煎煮次數對其提取率影響較低，可能是由于黃酮類成分的溶解度較高，對提取水總量要求較低。通過驗證實驗，確定可用于黃芩配方顆粒的最佳水提工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。在此條件下，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類成分提取率和出膏率高且穩定，且提取方法穩定可靠，可為黃芩配方顆粒的制備及進一步研究提供良好的實驗基礎和參考依據。

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OptimizationofthewaterextractionconditionsofHuangqindispensinggranulesbyorthogonaltest

HAOCui1,2,MUYan2,ZHAOHeng-qiang2,CUILi2,LIUWei2,LIUFeng-qin3*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology,ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014,China; 3.ShandongQianfoshanHospital,Jinan250014,China)

∶For the optimization of the water extraction conditions of Huangqin dispensing granules, orthogonal test method was used to investigate the effects of 3 factors, including different water volumes, extraction frequency and extraction duration, on the total content of baicalin, wogonoside, baicalein and wogonin and the extract rate. Meanwhile, the methodology of the HPLC determination was verified. As a result, under the experiment conditions, the importance order was as follows: extraction duration,extraction frequency,water volume. And extraction durations at different level were significant different (P<0.05). The experiment proved that the suitable extraction condition was that Huangqin slices were added 10 times volume of water and extracted 3 times for 1 h each time. The extraction condition optimized in this paper was practical and stable with high extraction rate of active ingredients, which was suitable to be used in the preparation of Huangqin dispensing granules.

∶orthogonal test; Huangqin dispensing granules; water extraction conditions

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.004

2017-05-27

山東省中醫藥科技發展計劃(2013-201)；山東省科技發展計劃(2013GSF1120)；山東省自然科學基金(ZR2013HM075，ZR2016YL006)

郝翠(1993—)，女，碩士研究生，研究方向為中藥新藥與中藥炮制原理。E-mail: hc56558 @163.com

*通信作者，劉逢芹，女，主任藥師，研究方向為中藥新劑型與臨床藥學。E-mail: 13791120885@163.com

R284.2

A

1002-4026(2017)06-0022-07