CHO細胞培養生產抗體產量的穩定性

張 進, 王星懿, 范 里, 譚文松

(華東理工大學生物工程學院,生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

CHO細胞培養生產抗體產量的穩定性

張 進, 王星懿, 范 里, 譚文松

(華東理工大學生物工程學院,生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

實現了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞高密度培養過程的穩定。以表達IgG抗體的流加培養過程為研究對象,首先通過“魚骨圖”分析、FMEA風險評估剖析潛在的關鍵控制參數,其次通過DOE (實驗設計)方法確定和優化關鍵控制參數及其范圍。結果表明,在99個培養過程參數中搜尋并確認了8個關鍵控制參數及其范圍。經優化控制后,表達IgG抗體的流加培養過程批次間抗體產量差異從200%下降至10%。基于QbD理論,能快速有效地實現CHO細胞培養生產抗體產量的穩定性,有利于保證抗體藥物生產的安全性以及保障企業的經濟效益。

細胞培養技術; QbD; FMEA; 設計范圍; 過程控制

抗體藥物在乙肝、腫瘤、自身免疫病、病毒感染病等疾病的治療中發揮重要作用,是生物醫藥的重要組成部分[1-2]。目前動物細胞培養技術是抗體藥物生產的主要手段[3],但是細胞培養過程中涉及的參數多達100多種且大部分隨時間變動[4-16],如溫度、pH、溶解二氧化碳、溶解氧、滲透壓、乳酸、氨等不同程度地影響細胞生長、代謝、抗體產量及質量,使得細胞培養過程十分復雜,很難進行控制。細胞培養過程的不穩定,一方面使得不同批次細胞培養的最終抗體產量和質量不一致,影響抗體藥物的安全性;另一方面,增加細胞培養過程失效的可能性,產生資源浪費,降低企業生產的經濟效益。

為了控制藥物生產過程的穩定,在2004年“質量源于設計”(QbD)理念被提出,并普遍應用于小分子藥物生產中,但在生物制藥中應用較少[17]。QbD理念提倡在藥物開發過程中構建產品質量,這一觀念促使人們探究原料和過程參數對藥物關鍵質量屬性(CQAs)的影響,通過對生產過程進行控制以達到穩定的目的[17]。在QbD理念的實施過程中,“設計空間”是一項重要的工具,它是指輸入變量和過程參數多元結合和相互作用,輸入變量和過程參數在該設計空間內變動不會對產品質量造成影響[18]。基于QbD理念,Harms等[19]對畢赤酵母發酵產物的設計空間進行研究,結果表明該發酵過程較為穩定,過程中的參數都不顯著影響產物質量;Amadeo等[20]對治療性重組蛋白下游純化最穩定、最適的工作條件進行了探究;Cook等[21]對單克隆抗體純化過程的關鍵參數進行鑒定并探究其設計空間;Abu-Absi等[18]對細胞培養過程中影響抗體質量的關鍵過程參數的設計空間進行系統地研究。但QbD理念在細胞培養過程穩定性方面的應用不廣泛,目前鮮有針對細胞培養過程產物產量穩定性的研究。

本文以表達IgG抗體的流加培養過程為研究對象,為實現不同批次細胞培養過程中抗體產量的穩定,借鑒QbD理念對于藥物產品“設計空間”的研究,首先采用“魚骨圖”分析法羅列可能影響抗體產量穩定的因素、失效模型和效應分析(FMEA)方法對上述因素進行風險評估確定其中可能的關鍵因素,其次通過DOE (實驗設計)方法確定關鍵因素并優化其控制范圍,最后通過對關鍵因素進行控制以實現流加培養過程的抗體產量穩定。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的細胞株為中國倉鼠卵巢細胞(CHO),由浙江海正藥業有限公司提供。該細胞表達的產物為IgG抗體。

細胞傳代所用的培養基為商業無血清培養基Mab-Works Medium C,并添加NaHCO3(1.83 g/L),4-羥基哌嗪乙磺酸(HEPES) (3.57 g/L)。基礎培養基及流加培養基由實驗室自行開發。配制培養基所用的試劑均采購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 技術路線圖 本文的技術路線如圖1所示。

圖1 技術路線圖Fig.1 Technology route map

1.2.2 “魚骨圖”分析法 “魚骨圖”分析法是一種羅列系統中存在的工藝參數的方法,它將所關注的目標(VOC)標在魚頭外,通過“頭腦風暴”形式,從“人、機、料、法、環”等方面分析,以“魚刺”的形式將系統所涉及的工藝參數羅列在兩側。

1.2.3 FMEA方法 由于細胞培養過程中所涉及的參數眾多,若將所有工藝參數進行優化設計將耗費大量人力、物力和財力。采用FMEA方法可以評估工藝參數影響抗體產量穩定性的風險,從而對過程進行前瞻性預測[22],以便我們挑選風險較大的工藝參數進行后續的優化工作。FMEA是基于已有數據、文獻報道或者以往經驗對該工藝參數的失效模式可能產生的后果進行風險評估,從嚴重性(S)、發生頻率(O)和易檢測度(D) 3個方面進行打分[23]。打分人員應由熟悉細胞培養過程的專業人士構成,不少于10人。將三者平均值相乘,計算風險優先系數(RPN)值,RPN值越高表示失敗的風險越高,該因素越有可能對過程產生影響,在后續的研究中應優先考慮[23]。

1.2.4 DOE優化設計 在運用FMEA方法確定影響抗體產量穩定性可能因素的優先次序后,采用DOE的方法探究關鍵參數、非關鍵參數以及關鍵參數的控制措施。在本研究中使用的DOE方法包括Plackett-Burman設計和單因素實驗設計。

在本研究中,對參數的分類是基于FMEA風險評估和DOE實驗結果兩方面的考量,如果參數經FMEA分析后RPN值占前10%,并且經過DOE驗證顯著影響抗體產量,則該參數定義為影響抗體產量穩定的關鍵參數[23]。

1.2.5 分析方法 CHO細胞計數采用臺盼藍染色法。抗體產量檢測采用高效液相色譜法,用積分的形式獲得峰面積,并與標準品的峰面積進行對比,求得樣品的濃度。

1.2.6 細胞培養過程穩定性定義 細胞過程穩定定義為:采用相同的工藝條件進行至少3個批次的細胞培養,抗體產量質量濃度的最大差異不超過10%。用公式(1)和(2)表示,當Δtiter≤10%時,可認為過程達到穩定。

其中ρmax為抗體產量質量濃度的最大值,ρmin為抗體質量濃度的最小值,單位為g/L。Relative titer是抗體產量質量濃度相對比值,它是細胞培養某一批次的抗體產量質量濃度與所有批次中抗體產量質量濃度最小值的比值,為方便敘述,統稱為相對產量。Max (Relative titer)是細胞培養所有批次中抗體產量質量濃度的最大值與最小值的比值。

2 結果與分析

2.1 采用CHO細胞培養生產抗體過程中產量不穩定現象的描述

采用相同的工藝條件,對CHO細胞進行5批流加培養實驗,經過14 d的培養,抗體相對產量如圖2所示。由圖2可知,抗體產量最高和最低分別為C4和 C2批次,兩個批次抗體產量差異Δtiter為200%,遠大于10%,說明在原有的培養工藝條件下,抗體產量不穩定。

圖2 原工藝條件下5個批次細胞培養的抗體產量相對比值Fig.2 Relative antibody titer of five batches cell culture under the condition of original process

2.2 采用“魚骨圖”分析法剖析CHO細胞培養過程

采用“魚骨圖”分析法剖析CHO細胞培養過程可能影響抗體產量穩定性的因素,結果如圖3所示。整個細胞培養過程可分為細胞凍存、細胞復蘇、細胞擴培以及細胞培養4個步驟,從“人、機、料、法、環”5個方面歸納總結每個步驟的輸入參數,經分析得到可能影響抗體產量的因素有99個,在不同批次的細胞培養過程中,這些因素難以控制一致,使得細胞培養過程中難以達到抗體產量穩定性。

2.3 采用FMEA方法分析影響抗體產量穩定性的潛在關鍵因素

將“魚骨圖”分析出的可能影響抗體產量穩定性的因素轉化成調查問卷,進行FMEA風險評估,標準見表1。首先,對調查問卷中的因素從嚴重性(S)、發生率(O)和檢測率(D) 3個方面打分,其中S是該因素對細胞培養過程產生影響的程度,將其分值設置為1～5分,最低分1分表示幾乎不對細胞培養過程產生影響,最高分5分表示導致細胞培養過程失敗;O是指該因素在細胞培養過程出現的頻率,出現次數高的因素相應的分值較高;D是指在細胞培養過程中通過控制該因素被檢測出來的可能性,被檢測出的可能性小相應的分值高。其次,將各因素的S、O、D的分值相乘,計算風險優先系數RPN值。FMEA分析后的部分結果見表2。

圖3 CHO細胞培養生產抗體過程魚骨圖Fig.3 Fishbone diagram of CHO cell culture producing antibody process

ScoreS O D 1InfluenceoncellcultureprocesscanbeignoredDonothappenAlmostcertainlytobecheckedout2InfluenceoncellcultureprocessissmallRarelyoccurHighpossibilitytobecheckedout3InfluenceoncellcultureprocessismediumSometimesoccurMediumpossibilitytobecheckedout4InfluenceoncellcultureprocessislargeOftenoccurSmallpossibilitytobecheckedout5LeadtothefailureofcellcultureprocessAlwaysoccurNopossibilitytobecheckedout

表2 CHO細胞培養過程部分FMEA分析表

最后,在對CHO細胞培養過程進行FMEA分析后,選定RPN值最高的前5個因素作為潛在的關鍵因素,進行下一步的研究。這5個因素分別為種子細胞比生長速率、基礎培養基的初始pH值、接種方式、取樣體積、N-1代種子細胞的傳代培養基是否更換為基礎培養基。

2.4 通過DOE方法確定影響抗體產量穩定性的關鍵因素及控制范圍

對選定的5個潛在的關鍵因素進行Plackett-Burman實驗,每個因素設置一個高水平和一個低水平,實驗結果如圖4所示。圖4(a)所示為細胞生長曲線,從圖中可知這12組實驗細胞生長狀況差異較大,大多數實驗組細胞在第6 d達到生長的最大密度,最高為12.5×106cells/mL,而最低為6×106cells/mL,相差約1倍。圖4(b)所示為抗體相對產量,這12組實驗抗體產量最高的為第7組,最低的為第10組,相差12%。

將抗體產量作為響應值,對實驗數據進行方差分析,如表3所示。其中AdjSS為調整后的離散差平方和;AdjMS為調整后的平均方差和,是調整后的離散差平方和與自由度的比值;F值是方差分析中的一個指標,是組間和組內的離散差平方和與自由度的比值,F值越大,P值越小,表示結果越可靠。當P<0.05時,說明因素為顯著性影響因素。實驗表明:種子細胞比生長速率,N-1代種子細胞的傳代培養基是否更換為基礎培養基,基礎培養基的初始pH,取樣體積這4個因素是抗體產量的顯著性影響因素。結合對CHO細胞培養過程關鍵參數的定義,這4個因素經FMEA分析 RPN值占前10%,且經過DOE驗證顯著影響抗體產量,是影響抗體產量穩定性的關鍵因素。在不同實驗批次中,若這些因素發生波動,且波動超出控制范圍,將引起抗體產量的不穩定。

采用單因素實驗對上述4個因素的控制范圍進行探究,在該控制范圍內變動,不對最終抗體產量產生影響。以N-1代種子細胞傳代時原傳代培養基與新鮮基礎培養基的體積比為例,實驗結果如圖5所示。

圖4 細胞生長曲線(a)以及抗體相對產量比值(b)Fig.4 Cell growth curve (a) and antibody relative titer (b)

DegreeoffreedomAdjSSAdjMSFPModel50．0160490．00321011．510．005Seedcellspecificgrowthrate10．0050110．00501111．510．005PassagemediumofN-1seedcellswhethertobereplacedbybasalmedium10．0040670．00406714．590．009InitialpHvalueofbasalmedium10．0029370．00293710．540．018Inoculationmethod10．0000950．0000950．340．580Samplevolume10．0039380．00393814．130．009Error60．0016730．000279Total110．017721

圖5 在N-1代種子細胞傳代時更換不同體積比培養基的條件下細胞生長(a)、產物表達情況(b)的比較Fig.5 Growth (a) and productivity (b) comparison under different replacement ratios of generation medium of N-1 seed cells

從細胞生長可以看出,N-1代細胞傳代仍采用原傳代培養基,細胞培養可持續12 d,最大細胞密度在第6 d達到,約為9×106cells/mL;N-1代細胞傳代時原傳代培養基與新鮮基礎培養基體積比為1∶1,細胞培養可維持10 d,最大細胞密度在第6 d達到,平均為9.3×106cells/mL;N-1代傳代時原傳代培養基與新鮮基礎培養基的體積比為1∶3時,細胞培養可維持10 d,最大細胞密度在第4 d達到,約為8.7×106cells/mL。雖然最大活細胞密度差異不大,但N-1代細胞傳代采用原種子培養基,細胞在第6 d之后,活細胞密度下降較慢。

最終抗體產量在N-1代傳代培養基不更換的條件下較高,并且該條件與1∶1更換和1∶3更換的條件相比,抗體產量有顯著差異(P<0.05)。結果表明,N-1代種子細胞傳代培養基不更換時,有利于抗體產生,若由于工藝條件的設置需要更換N-1代傳代培養基時,原傳代培養基與加入新鮮基礎培養基的比例維持在1∶1～1∶3時,不影響抗體產量。

本文對其他影響抗體產量穩定性的關鍵因素及其控制范圍也進行了探討,匯總如表4所示。

表4 影響抗體產量穩定性的關鍵因素及其控制范圍

2.5 生產工藝改進及新工藝穩定性驗證

對上述影響抗體產量穩定性的關鍵因素進行控制,驗證新工藝是否達到穩定。對關鍵因素的控制條件為:N-1代種子細胞的傳代培養基不更換為接種時的基礎培養基,接種時種子細胞密度為1.5×106～1.8×106cells/mL,細胞的比生長速率在0.6～0.7 d-1之間,基礎培養基的初始pH在7.0～7.2,采用離心接種的方式,使細胞初始接種密度為0.8×106～1.2×106cells/mL,離心后細胞放置時間小于10 min,取樣體積為400 μL。實驗共4個批次,每個批次設置3個平行,最終抗體產量相對比值如圖6所示。

由圖6可知在新工藝條件下進行4個批次的細胞培養,抗體產量最高和最低分別為C2和C3批次,抗體產量的差異Δtiter為10%,基本滿足對細胞培養過程穩定性的要求。與原工藝條件相比,抗體產量的差異從200%下降至10%,說明在對CHO細胞培養過程影響抗體產量穩定的關鍵因素進行控制之后,抗體產量穩定性提高。

圖6 新工藝條件下4個批次細胞培養的抗體相對產量Fig.6 Relative antibody titer of four batches cell culture under the condition of new process

3 討 論

CHO細胞培養生產抗體的過程十分復雜,其中影響抗體產量穩定性的因素眾多,利用“魚骨圖”分析能夠有效地對過程進行拆分描述,并對其中可能影響抗體產量穩定的因素從“人、機、料、法、環”5個方面進行歸納總結,便于發現影響抗體產量穩定性的根本原因。在以往的研究中,“魚骨圖”常用于質量、生產管理、項目管理等領域問題的分析,作為一種定性分析工具,能夠幫助人們對問題產生的原因進行系統地評估[24]。趙靜等[25]運用“魚骨圖”對影響我國奶源質量安全的主要因素及存在的問題進行分析,提出了針對原料奶質量控制的建議及對策,具有較高的實際應用價值。Volchek等[26]運用“魚骨圖”方法對低質量的醫療衛生造成較高的資源消耗的原因以及組成部分進行了詳細地研究,對于這一問題的解決提供了一定的思路。

FMEA分析是生產過程中一項重要的工具,是對過程中存在的故障模式及其可能產生的影響進行分析,通過采取事前預防的措施,對過程進行改進或控制,目前廣泛應用于軍事、建筑安裝工程、船舶與海洋工程、醫療衛生、軟件工程及信息系統開發、核工業與食品安全等領域[27]。在過程定性研究中,常利用FMEA對過程的操作參數進行風險評估,確定參數進行實驗驗證的優先次序。本研究中,通過“魚骨圖”分析出細胞培養過程影響抗體產量穩定的可能輸入參數有99個,如果對這些參數均設計實驗進行驗證,將消耗大量的人力、物力、財力。通過FMEA風險評估,排除可能性較小的因素,選取RPN值較高的因素進行DOE探究,實現問題的簡化。

通過DOE驗證得出影響抗體產量穩定的因素,包括N-1代細胞傳代的傳代培養基是否更換為基礎培養基、細胞比生長速率、基礎培養基的初始pH、取樣體積、基礎培養基的存放時間、細胞離心后放置時間、細胞初始接種密度、種子細胞密度等。文獻[28]報道在37 ℃時,隨著CHO細胞比生長速率的提高,r蛋白的比生產速率逐漸提高,比生長速率對產物表達有較大影響,這與本研究的結果一致;文獻[10]報道pH是細胞培養過程中重要的測量及控制參數,對細胞生長代謝及產物表達有重要作用,本研究表明基礎培養基的pH對最終抗體表達影響較大;培養基中的谷氨酰胺是細胞生長重要的碳源、氮源及能源物質,可通過能量代謝為細胞生長及產物合成提供30%～65%的能量,維生素等物質是維持細胞正常生理狀態的重要物質[29],但它們易分解。基礎培養基存放時間較長可能造成上述營養物質的缺失,影響細胞生長及產物表達;Abu-Absi等[18]在研究生產單抗的細胞培養過程的設計空間時,發現初始接種密度是影響抗體產量的關鍵因素,Padawer等[30]發現初始接種密度高的條件下,抗體產量較高,但是細胞凋亡較快,這些研究表明細胞初始接種密度對抗體產量影響較大;Rodriguez等[31]報道種子細胞密度很小的差異就會引起細胞比生長速率產生較大的變化,種子細胞密度可能影響細胞生長進而影響抗體表達。

目前,鮮有針對CHO細胞培養生產抗體過程產量穩定的報道,而保證細胞培養不同批次間抗體產量的穩定,不僅能夠保證實驗數據的可靠性與可重復性,而且能夠滿足抗體生產過程對工藝穩定性的要求,對于保證藥品生產的安全性及企業的經濟效益具有重要作用。本文基于QbD理念,首先通過“魚骨圖”剖析CHO細胞培養過程,其次通過FMEA對可能影響抗體產量穩定的因素進行風險評估,選取RPN值高的因素作為潛在的關鍵影響因素,然后采用DOE方法,確定其中的關鍵影響因素及其控制措施,最終在99個可能影響抗體產量穩定的因素中,篩選并得到了8個關鍵因素及控制范圍,經過優化控制后批次間抗體產量的差異從200%縮小至10%,抗體產量穩定性大大提高。本研究填補了CHO細胞培養在抗體產量穩定方面研究的空白,為過程穩定性的研究提供新的思路,具有較高的應用價值。

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TiterStabilityofAntibodyProducedbyCHOCellCulture

ZHANGJin,WANGXing-yi,FANLi,TANWen-song

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofBioengineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)

The stability of Chinese hamster ovary (CHO) cells during high density cultivation process was realized.The fed-batch culture process expressing IgG antibody was studied based on QbD theory.Firstly,potential critical control parameters were dissected by using “fishbone diagram” analysis and Failure Mode and Effect Analysis (FMEA).Secondly,key control parameters were determined and their design ranges were optimized by DOE (Design of experiment) method.Results show that eight key control parameters and their scope were searched and confirmed within 99 cell culture process parameters.Through optimization and control,difference of antibody titer between batches of fed-batch culture process decreases from 200% to 10%.Based on QbD theory,it can rapidly and effectively achieve process stability of antibody production by CHO cell culture which is benefit for the safety of antibody drug production and the economic benefits of enterprises.

cell culture technology; QbD; FMEA; design space; process control

1006-3080(2017)06-0806-09

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.06.009

2017-05-04

張 進(1992-),女,河南人,碩士生,主要從事動物細胞培養的研究。E-mail:zhangjinecust@163.com

譚文松,E-mail:wstan@ecust.edu.cn

Q813.1+1

A