餐廚垃圾厭氧消化過程中厭氧菌的分離培養★

鄭巧利 王鵬茂 張廣何 薛佳平

(同濟大學浙江學院，浙江 嘉興 314051)

餐廚垃圾產量高、成分復雜，可生物降解能力強，資源化利用空間很大，但未經妥善處理的餐廚垃圾危害也極大，因此餐廚垃圾進行資源化處理具有十分重要的意義和發展前景。餐廚垃圾處理技術主要有飼料化、堆肥化和厭氧消化等，而厭氧消化技術是目前最常用的餐廚垃圾處理技術[1]。厭氧消化技術的重要研究方向之一就是消化過程中厭氧菌的分離培養和鑒定。如金映虹[1]從厭氧消化池活性污泥中采集樣品，利用特定培養基進行厭氧培養，分離篩選得到2株產甲烷菌。汪婷[2]研究了牛糞為消化原料的沼氣發酵過程中產甲烷菌分子多樣性及產甲烷菌的分離。本文則以餐廚垃圾為研究對象，以餐廚垃圾和污泥聯合發酵過程中的消化液為菌種來源，進行培養和初步鑒定。

1 實驗材料和藥品

實驗所用設備和材料主要有：亨蓋特厭氧滾管機，恒溫培養箱，分析天平，燒杯，錐形瓶，干燥器，量筒，小燒杯，無菌培養皿，無菌吸管，酒精燈，移液管，pH試紙，厭氧試管等。

實驗所用藥品主要有：牛肉浸膏，胰蛋白胨，酵母浸膏，胰蛋白酶，瓊脂，L—半胱氨酸鹽，NaOH，NH4CI，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，CuSO4，FeSO4，H3BO3，CoSO4，Na2S，NaHCO3。

2 菌種來源

餐廚垃圾來自某高校食堂，主要成分是米飯、蔬菜、豬肉，用破碎機破碎后混合均勻。聯合發酵污泥取自某河流河底淤泥，接種物來自污水處理廠厭氧消化池。餐廚垃圾、聯合發酵污泥、厭氧接種物一起加入細口瓶中，至于35 ℃恒溫培養箱中培養數日，取上層消化液作為待研究樣品。

3 實驗方法

3.1 培養基的配制

配制瓊脂培養基200 mL，配方為：NH4Cl 0.2 g，酵母浸膏0.2 g，KH2PO40.08 g，K2HPO40.08 g，胰蛋白胨0.4 g，瓊脂4 g，無機鹽溶液10 mL，微量元素2 mL，超純水定容至200 mL。培養基煮沸10 min后通入無氧N2，驅氧10 min后加入L—半胱氨酸鹽0.1 g，分裝至厭氧試管中。

在每支瓊脂培養管中，用1 mL注射器分別加入硫化鈉(質量分數1%)和碳酸氫鈉(質量分數5%)混合試劑0.1 mL、青霉素液0.1 mL、乙酸鈉(2.5 mol/L)0.1 mL、甲酸鈉(質量分數25%)0.1 mL、甲醇(質量分數50%)0.1 mL[4]。

3.2 樣品稀釋

取上述餐廚垃圾厭氧消化液進行稀釋，稀釋過程如下：

在錐形瓶中加入無菌水90 mL；取若干支試管分別加入9 mL無菌水，依次排列。

先用10 mL移液管取10 mL厭氧消化原液至錐形瓶中(內裝有90 mL無菌水)，充分搖勻、打碎(約5 min)，即稀釋為10-1濃度。

接著用1 mL移液管取1 mL 10-1濃度的樣品至試管(內裝有9 mL無菌水)中，充分搖勻,即稀釋為10-2濃度。依此方法進一步得到10-3,10-4稀釋度。

3.3 接種與培養

將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養基試管放置于50 ℃左右的恒溫水浴中，用1 mL無菌注射器分別吸取10-1,10-2,10-3,10-4稀釋度的稀釋液各0.1 mL于融化了的瓊脂培養基試管中，蓋緊試管蓋子后將其平放于厭氧滾管機上迅速滾動，這樣帶菌的培養基在試管內壁立即凝固成瓊脂薄膜。每個稀釋度重復3次。將厭氧試管置于35 ℃恒溫培養箱中培養(見圖1)。培養10 d后，在厭氧管的瓊脂層內長出肉眼可見的菌落(見圖2)。

3.4 革蘭氏染色

在潔凈的載玻片中央滴一小滴蒸餾水，用接種環挑取少許上述所得厭氧管中的菌體，與玻片上的水滴混合均勻，并涂成薄的菌膜后固定。滴加草酸銨結晶紫染色液進行初染，再滴加沙黃(番紅)溶液進行復染[5],水洗并干燥后采用顯微鏡進行鏡檢(油鏡，10×100倍)，得到結果見圖3。根據呈現的顏色判斷該菌屬革蘭氏陽性菌(G+細菌)。

4 結語

以餐廚垃圾厭氧消化液作為研究對象，將不同稀釋度的消化液接種在特定培養基上，采用亨蓋特(Hungate)厭氧滾管技術進行分離培養，得到厭氧菌落，經革蘭氏染色及顯微鏡觀察確定為革蘭氏陽性菌。