酵母型生物絮凝劑產生菌的篩選及培養基優化

陳成，鐘雨雪，夏祥，邱成書，陳存，謝翼飛＊

（1.成都師范學院化學與生命科學學院，四川成都611130；2.中國科學院成都生物研究所，四川成都610041）

酵母型生物絮凝劑產生菌的篩選及培養基優化

陳成1，鐘雨雪1，夏祥2，邱成書1，陳存1，謝翼飛2＊

（1.成都師范學院化學與生命科學學院，四川成都611130；2.中國科學院成都生物研究所，四川成都610041）

目的：獲得高效的酵母菌型絮凝劑。方法：以代表性的高嶺土懸濁液、養殖場廢水、土壤上清液、藻液、硫酸銅溶液、發酵廢水作為測試廢水，篩選具有絮凝活性的菌種。結果：篩選出3株具有絮凝活性的菌種，其中酵母1-4絮凝效果較好且適用范圍較廣；對酵母1-4菌培養基的碳源、氮源、碳氮比進行優化，確定最適碳源為甘露醇，最適氮源為氯化銨，碳氮比5∶1為最佳。結論：用醇降法提取優化培養所得的絮凝劑，產率為5.0g/L，經紫外吸收光譜和茚三酮反應初步判斷絮凝劑的主要成分為蛋白質。

酵母菌；生物絮凝劑；高嶺土懸濁液；培養基優化

生物絮凝劑是一類天然高分子絮凝劑，是通過微生物發酵、分離提取而得到的一種高效、無毒且易降解的新型污水處理劑[1]。與傳統絮凝劑相比，具有安全性高、生物降解性良好、易于固液分離、無二次污染、用量少等優點[2-5]，能快速絮凝各種顆粒物質，廣泛用于去除水體中的懸浮物質[6]、COD[7]、重金屬[8-9]、腐殖酸[10]等，在廢水脫色、高濃度有機物去除等方面效果顯著[11-13]，有著很大的研究價值和應用前景。

我國對生物絮凝劑的研究起步相對較晚，目前多數處于菌種的篩選階段。雖然生物絮凝劑在水處理方面有著突出的優越性，但從規模化生產和應用角度來看，還存在著一系列亟待解決的問題，如高效絮凝劑產生菌的篩選和培育、絮凝活性的提高、尋找廉價的培養基等。研究發現，能夠產生絮凝劑的微生物種類繁多，包括細菌、放線菌、真菌、霉菌、酵母菌和某些藻類等[14]，但現有的研究以細菌為主，對酵母型生物絮凝劑研究相對較少。不同菌種產生的絮凝成分差別較大，而不同的培養條件也會對絮凝效果和產量產生較大的影響。本文以酵母型絮凝劑產生菌為研究對象，在篩選生物絮凝劑產生菌株的基礎上，采用高嶺土懸濁液模擬待處理的廢水，對高活性菌株的培養基進行優化，力求獲得高效高產量的酵母型產絮菌及培養條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇（AR，上海精細化工試劑有限公司）、酵母膏（BR，北京奧博星生物）、胰蛋白胨（BR，北京奧博星生物）、YPD培養基（BR，北京奧博星生物）、CuSO4（AR，天津美琳），其余試劑皆購于天津市科密歐化學試劑有限公司，純度為分析純。

1.2 儀器與設備

高速離心機：蜀科TG-16；電子天平：梅特勒-托利多A1-104；六聯攪拌器：磁力數顯控溫攪拌器HJ-6A；電熱恒溫培養箱：DHP-600；恒溫振蕩器：IS-R0V1；pH計：雷磁PHB-4；雙光束紫外可見分光光度計：普析TU-1901。

1.3 方法

1.3.1 高效酵母型生物絮凝劑產生菌的篩選

YPD培養基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂粉 20g、H2O 1 000mL，115℃滅菌 30min。

發酵培養基：葡萄糖20.0g、蛋白胨0.5g、酵母膏 0.5g、(NH4)2SO40.2g、K2HPO45.0g、KH2PO42.0g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、1 000mL，pH=8.0，115 ℃ 滅菌30min。

種子培養基：蛋白胨5.0g、酵母膏15.0g、氯化鈉4.0g、葡萄糖 10.0g、H2O 1 000mL、pH=7.0，115℃滅菌30min。

將實驗室保存的酵母菌種接種到YPD培養基，28℃恒溫活化培養10h后接種到50mL液體發酵培養基，28℃、180r/min振蕩培養24h。向6個燒杯中分別加入高嶺土懸濁液、養殖場廢水、CuSO4溶液、發酵廢水、藻液、土壤上清液各20mL，再分別加入0.2mL發酵液，1mL1%CaCl2，快速攪拌1min，慢速攪拌4min，觀察絮凝效果。

1.3.2 培養基優化

（1）碳源優化。分別以淀粉、甘露醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖作為碳源，將菌種接入種子培養基，28℃180r/min恒溫振蕩培養10h。取菌液接種到發酵培養基培養24h后，以20mL高嶺土懸濁液為測試液，加入1mLCaCl2混勻后靜置10min，測定上清液在550nm下的吸光度（OD550）。將菌液稀釋10倍后，測定其在600nm下的吸光度（OD600）。

（2）氮源優化。分別以(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作為氮源，在碳源最優條件下，其余操作同上。

（3）碳氮比優化。調節C/N比分別為10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10進行發酵培養，在碳源、氮源最優條件下，其余操作同上。

1.3.3 絮凝劑成分的分析

向150mL預冷的無水乙醇中加入50mL發酵液，于-4℃條件下靜置8h，6 000r/min離心20min，棄去上清液，將沉淀放于烘箱中用40℃烘干至恒重。所得絮凝劑用紫外可見分光光度計掃描其吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 高效酵母型絮凝劑產生菌的篩選

實驗分離純化出酵母型菌株20株，以高嶺土懸濁液、養殖場廢水、CuSO4溶液、發酵廢水、藻液、土壤上清液6種代表性廢水做篩選，選出的菌種絮凝效果實用性與適用性比單一廢水篩選更強。實驗結果見表1。酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8有明顯的絮凝活性，三者絮凝情況對比如圖1所示。可以看出，酵母1-4菌對土壤上清液、藻液、高嶺土懸濁液等都有明顯的效果，適用范圍較廣，且絮凝效果優于酵母1-7與酵母1-8。

2.2 培養基優化

以絮凝效果最好的酵母1-4菌為菌種優化發酵培養基配方。碳源優化結果見表2，OD550越小上清液越澄清，發酵液絮凝效果越好，OD600數值越高表明發酵液中菌種生長狀況越好。以甘露醇作為碳源，OD550數值最低，絮凝效果最好，其OD600數值僅次于葡萄糖，菌種生長狀況較好。因而，兼顧絮凝效果與菌種生長情況，確定甘露醇為最適碳源。

表1 菌株絮凝效果

圖1 三株酵母菌的絮凝效果

表2 碳源優化結果

以甘露醇作為碳源，(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作為氮源，絮凝效果和菌種生長情況見表3。以NH4Cl作為培養基氮源，測得OD550最低，絮凝效果最好，OD600數值最高，菌種生長狀況最好。因而確定NH4Cl作為最佳氮源。

表3 氮源優化結果

在碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl的條件下，優化培養基的碳氮比，測得OD550、OD600值見表4。比較可得當碳氮比為5∶1時，OD550最低，OD600最高，絮凝效果最好且菌種生長狀況最好。故優化后的發酵培養基的碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl，碳氮比為5∶1。

表4 碳氮比優化結果

2.3 絮凝劑成分的初步鑒定

采用醇降法分離提取優化培養24h的酵母1-4菌所產出的絮凝劑，測得產量為每50mL發酵液0.25g。利用紫外可見分光光度計測得絮凝劑于260nm處有吸收峰，茚三酮反應呈紫色，可初步確定酵母1-4菌株產生的絮凝劑主要成分為蛋白質。

3 結論

從實驗室保藏菌種中分離純化出的20株酵母菌，并篩選出3株具有較好絮凝效果的酵母菌，即酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8，其中酵母1-4絮凝效果最優且適用范圍更廣。以酵母1-4菌為菌種優化發酵培養基配方，考慮絮凝效果與菌種生長情況下，優化后發酵培養基的碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl，碳氮比為5∶1。采用醇降法分離提取酵母1-4產出的絮凝劑，產量為每50mL發酵液0.25g。利用紫外可見分光光度計測得絮凝劑于260nm處有吸收峰，且茚三酮反應呈紫色，證明絮凝劑主要成分為蛋白質。

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Screening and Medium Optimization of High-efficiency Flocculant-producing Yeast

Chen Cheng1,Zhong Yu-xue1,Xia Xiang2,Qiu Cheng-shu1,Chen Cun1,Xie Yi-fei2*
(1.School of Chemistry and Life Science,Chengdu Normal University，Sichuan Chengdu 611130;2.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Sichuan Chengdu 610041)

Objective:To obtain an efficient yeast flocculant.Methods:the flocculation activity test for kaolin suspension,farm wastewater,soil supernatant,algae solution,copper sulfate solution and fermentation wastewater.Results:Three flocculant-producing yeasts were screened,in whichYeast1-4 has the highest flocculation efficiency and could be applicable to for more kinds of wastewater.The medium constituents of Yeast1-4 was optimized and the results showed that,the optimum carbon source was mannitol,the optimum nitrogen source was ammonium chloride and the optimum C/N ratio was 5∶1.Conclusion:Under this conditions,the flocculantyield of Yeast1-4 is 5.0g/L.The main ingredient of flocculant is identified to be protein by UV spectroscopy andninhydrin reaction.

Yeast;Bioflocculant;Kaolin suspension;Medium optimization

X172 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-009-04

四川省教育廳科研項目（17ZB0072）；四川省大學生創新創業訓練計劃（107260127）。

陳成（1984—），女，四川南充人，博士在讀，講師，研究方向：水處理技術。

謝翼飛（1977—），男，江蘇武進人，博士，副研究員，研究方向：環境微生物。