蠲痹歷節清酊對大鼠急性痛風性關節炎模型滑膜組織中ICAM-1、NF-κB 表達的影響

陸小龍 ，曾 朋 ，向黎黎 ，熊 輝 ，齊新宇 ，郭玉星 ，周 彪

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

·方藥研究·

蠲痹歷節清酊對大鼠急性痛風性關節炎模型滑膜組織中ICAM-1、NF-κB 表達的影響

陸小龍1，曾 朋1，向黎黎1，熊 輝2*，齊新宇2，郭玉星1，周 彪2

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的初步探討蠲痹歷節清酊對大鼠急性痛風性關節炎模型的作用機制。方法選用SPF級健康雄性SD大鼠 40只，分成蠲痹歷節清酊組、扶他林軟膏組、模型組、空白對照組，每組10只。對前三組采用踝關節腔注射尿酸鈉溶液造成急性痛風性關節炎模型，并予以相應干預。觀察各組大鼠造模后一般狀態；用縛線法檢測大鼠踝關節腫脹度；光鏡下觀察踝關節滑膜的病理變化；采用免疫組化染色檢測滑膜組織中細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和核轉錄因子（NF-κB）含量。結果與模型組比較，扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組腫脹度降低（P＜0.05）；大鼠踝關節滑膜光鏡觀察：空白對照組滑膜組織結構整齊、層次分明。模型組滑膜組織結構損壞、層次混亂，組織充血、水腫，大量炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生，少量巨噬細胞浸潤；扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組與模型組比較改善明顯；大鼠踝關節滑膜組織中，空白對照組與模型組ICAM-1、NF-κB表達比較差異有統計學意義（P＜0.05）。扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組與模型組ICAM-1、NF-κB表達比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論蠲痹歷節清酊具有緩解腫脹、改善滑膜炎癥、抑制關節滑膜中ICAM-1、NF-κB表達的作用。

蠲痹歷節清酊；痛風性關節炎；ICAM-1；NF-κB

痛風(Gout)是體內嘌呤代謝紊亂導致的代謝性疾病，病因是尿酸鹽在關節及關節周圍組織中沉積引起的急性炎癥反應，其發生與體內嘌呤代謝障礙和（或）尿酸排泄減少致血尿酸升高有關[1]，近年來國內該病的發病率逐年升高[2]。本團隊根據痛風性關節炎的病機及發病特點，在臨床應用中藥蠲痹歷節清方治療急性痛風性關節炎取得了滿意的臨床療效[3-4]。本課題通過改變劑型和作用途徑，將蠲痹歷節清方由水煎劑改成酊劑，為驗證其療效及探討可能的作用機制，進行了蠲痹利節清酊干預大鼠急性痛風性關節炎模型實驗，現將其報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級健康雄性SD大鼠 40只，體質量（194.50±19.21）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心采購，許可證號：SYXK(湘)2015-0004。實驗通過醫學實驗動物倫理委員會批準，在湖南中醫藥大學動物實驗中心飼養、造模，實驗，隔2日清潔1次鼠籠。

1.2 實驗藥物

蠲痹歷節清方由蒼術、茵陳、黃柏、黃芩、當歸、防己、澤瀉、土茯苓、白術、甘草等配伍組成，稱取蠲痹歷節清方藥粉碎成粗粉，加75%乙醇900 mL浸漬，3 d后濾過，藥渣壓榨，濾液與榨出液合并，靜置24 h，濾過，合并濾液，補充75%乙醇至1 000 mL，攪勻，分裝，密封即得。蠲痹歷節清酊50 mL/瓶，生藥含量約0.064 g/mL,由湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科制備。扶他林軟膏20 g/支，北京諾華制藥有限公司生產。

1.3 實驗試劑

尿酸結晶體（aladdin industrial corporation，批號：21041220）；蘇木素（武漢德士生物工程有限公司，批號：20141124）；大鼠細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)ELISA 試劑盒 [博燦生物科技（上海）有限公司，批號：20110224]；大鼠核轉錄因子（nuclear transcription factor,NF-kB)ELISA試劑盒[博燦生物科技（上海）有限公司，批號：20110303]。

1.4 實驗儀器

JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；LECIA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國LECIA公司）；MIAS醫學圖像分析系統（北航公司）；Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；MotisB5顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司）。

2 方法

2.1 動物分組

SPF級SD大鼠，喂養3 d后按隨機原則分為4組，即空白對照組、模型組、扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組，每組10只。4組動物在正常溫濕度（溫度24～28℃，相對濕度60%～75%）環境下，普通飼料喂養，自由飲水3 d，第4天開始實驗。

2.2 動物造模

除空白對照組外，其他組動物參照呂軍等[5]建立高尿酸血癥并急性痛風性關節炎大鼠模型的方法進行造模。按無菌操作方法，用4號注射針頭，用3%氧嗪酸鉀溶液1 mL/100 g行腹腔內注射，2次/d，連續注射1周后開始造模。將大鼠右小腿下段毛剔除后，常規消毒，用直徑0.25 mm注射針（5 mL注射器），取受試大鼠右后肢背側的踝關節正中與小腿之間的間隙，將5%尿酸鈉溶液50 μL注入關節腔。對照組大鼠同樣使用相同方法注射0.2 mL生理鹽水[6]。造模后大鼠關節紅腫，不欲行動，步履蹣跚或者跛行，飲食飲水較空白對照組少，根據Coderre等[7]大鼠步態分級評分標準，大鼠出現跛行，受試下肢剛觸及地面甚至受試下肢離開地面，三足著地行走為造模成功[1,8]。

2.3 動物給藥劑量[9]及方法

根據人與動物體表面積換算公式計算蠲痹歷節清酊組、扶他林軟膏組大鼠的給藥劑量。蠲痹歷節酊劑：規格50 mL/瓶，成人每次劑量為5 mL/d，每日給藥3次。根據人與動物體表面積換算公式，大鼠按1.35 mL/kg每天使用蠲痹歷節清酊，即每天使用生藥量為0.087 g/kg。扶他林軟膏：成人每次劑量為4 cm膏體，每日給藥3次。根據人與動物體表面積換算公式，扶他林軟膏組大鼠每次約使用0.7 cm。生理鹽水：模型組、空白對照組大鼠涂以等劑量醫用0.9%生理鹽水。

用分液器將蠲痹歷節清酊涂于蠲痹歷節清酊組大鼠右踝，使用棉簽將扶他林軟膏涂于扶他林軟膏組大鼠右踝，模型組、空白對照組大鼠涂以生理鹽水，用輸液貼覆蓋。每天3次，共干預3 d。

2.4 觀察指標

2.4.1 一般狀態 觀察各組大鼠的食量、水量、大小便、體質量、外觀、步態、精神狀態等的變化情況，做詳細記錄并進行對比分析。

2.4.2 踝關節腫脹度測定 第一次給藥前在各組大鼠右踝關節處用畫標志線，以確定給藥后量取相同部位，棉線繞其一圈后直尺量長度，作為給藥前右后肢踝關節周徑記為L1，給藥3 d后再次量取關節的周徑記為L2。以(L2-L1)/L1作為大鼠右后肢踝關節腫脹度。

2.4.3 踝關節滑膜組織鏡下形態學檢查 大鼠處死后，以踝關節為中心上下0.5 cm處剪斷，取下受試關節和周圍軟組織，分別快速切取踝關節滑膜，放入40 g/L中性甲醛溶液中固定，乙二胺四乙酸100 g/L脫鈣，常規脫水、透明、包埋、切片和HE染色，顯微鏡下觀察局部病理組織學變化。

2.4.4 滑膜組織中ICAM-1、NF-κB蛋白表達水平測定 取滑膜組織浸入生理鹽水中，使用10 mg/0.5 mL的濃度比例；將組織勻漿器放到冰盒中；用組織勻漿器進行勻漿，直至勻漿液體呈現均勻一致的懸濁液；將均勻一致的懸濁液倒入EP管中，將EP管用全自動離心機進行3 000 r/min的高速離心5 min，以分離勻漿液；用移液槍把上清液移至己經標記好的EP管內，存儲于-80℃冰箱里備用。用ELISA法檢測ICAM-1、NF-κB，嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.5 統計學分析

統計分析采用SPSS 20.0統計軟件分析，計量資料用“±s”表示。如果滿足正態性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的最小二乘法(LSD)法行多組均數間的兩兩比較，若不滿足方差齊性則采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般狀態比較

造模后，空白對照組大鼠體毛潤澤，活動自如，反應靈敏，飲食及二便正常；其余造模各組大鼠體毛欠光澤，精神欠佳，懶動，食量減少，大便稀溏，大鼠關節紅腫，不欲行動，步履蹣跚或者跛行，飲食飲水較空白對照組少。

3.2 關節滑膜組織形態觀察

空白對照組：鏡下可見滑膜組織無病理改變，結構整齊、層與層之間間隔分明，滑膜層細胞性內膜由1-3層細胞組成（圖1A）。模型組：鏡下可見滑膜組織病理改變，結構損壞、層與層之間間隔混亂，滑膜組織的充血、水腫，可見大量炎性細胞的浸潤，同時可見大量成纖維細胞的增生，少量巨噬細胞浸潤（圖1B）。扶他林軟膏組：鏡下可見滑膜組織病理改變，結構損壞、層與層之間間隔混亂，滑膜組織的充血、水腫，偶爾少量炎性細胞的浸潤，同時可見中量成纖維細胞的增生，少量巨噬細胞浸潤（圖1C）。蠲痹歷節清酊組：鏡下可見滑膜組織病理改變，結構損壞、層與層之間間隔混亂，滑膜組織的充血、水腫，偶爾可見炎性細胞的浸潤，同時可見中量成纖維細胞的增生，少量巨噬細胞浸潤（圖1D）。

圖1 大鼠踝關節滑膜組織形態光鏡圖（HE，×200）

3.3 大鼠關節腫脹度及滑膜組織中ICAM-1、NF-κB表達檢測

造模后，與空白對照組比較，模型組腫脹度增高（P＜0.05）；與模型組比較，扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組腫脹度降低（P＜0.05）；蠲痹歷節清酊組與扶他林軟膏組腫脹度比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。 見表 1。

與空白對照組比較，模型組滑膜組織中ICAM-1、NF-κB 的表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組滑膜組織中ICAM-1、NF-κB 的表達降低（P＜0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠關節腫脹度及滑膜組織中ICAM-1、NF-κB表達比較 （±s，n=10）

表1 各組大鼠關節腫脹度及滑膜組織中ICAM-1、NF-κB表達比較 （±s，n=10）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別空白對照組模型組扶他林軟膏組蠲痹歷節清酊組F值P值關節腫脹度0.02±0.01 0.23±0.03△0.14±0.01▲0.15±0.01▲23.67 0.01 ICAM-1/pg·mL-1 138.38±17.17 378.88±21.18△209.51±24.60▲181.85±25.35▲23.43 0.01 NF-κB/pg·mL-1 846.03±54.69 3065.60±146.35△1588.11±233.04▲1573.05±184.52▲11.51 0.00

4 討論

急性痛風性關節炎的研究者多從炎癥因子方面著手，IL-1[10]、IL-6、IL-8[11]、PGE2[12]、ICAM-1[13]等因子成為急性痛風性關節炎常用研究指標。隨著對炎癥發生機制研究的深入，ICAM受到廣泛關注，正常情況下ICAM-1表達較弱，在各種炎癥因子刺激下其表達較基線狀態明顯升高，促進炎癥細胞的趨化，并介導了中性粒細胞與內皮細胞的黏附，ICAM-1是急性炎癥發展過程中重要的一部分，與炎癥細胞的黏附、浸潤過程關系密切[14]。NF-κB[15]是細胞內一種重要的核轉錄因子，它在細胞因子誘導的基因表達中起關鍵性的調控作用，廣泛參與炎癥反應、免疫應答、細胞增殖和細胞凋亡等多種生理、病理過程的基因調控。正常情況下處于未活化狀態，NF-κB激活會引起本已發生的炎癥反應持續增強，其原理與促進炎性細胞過度分泌于炎癥部位有關。

本課題組在研究中醫藥治療痛風方面，做了許多的臨床研究和動物實驗[1-4，16]，旨在能夠研究出一種臨床療效確切，使用方法便利的藥物。本課題在蠲痹歷節清方的基礎上，改變劑型和作用途徑，由水煎劑轉變成酊劑，通過動物實驗，驗證其療效及作用機制，為蠲痹歷節清方的藥物開發提供實驗依據。

本文結果表明，關節腫脹度測定實驗中,扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組關節腫脹度與模型組比較降低（P＜0.05）；扶他林軟膏組與蠲痹歷節清酊組關節腫脹度比較，差異不具有統計學意義。說明扶他林軟膏與蠲痹歷節清酊均具有一定的消腫作用，其作用效果相當。通過光鏡觀察大鼠踝關節滑膜切片，空白對照組滑膜組織結構整齊、層次分明。模型組滑膜組織結構損壞、層次混亂，組織充血、水腫，大量炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生，少量巨噬細胞浸潤。扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組與模型組比較，少量炎性細胞、巨噬細胞浸潤，中量成纖維細胞增生，提示扶他林軟膏與蠲痹歷節清酊對滑膜增生性病變的影響相當。在大鼠滑膜組織ICAM-1、NF-κB的測定中，空白對照組與模型組ICAM-1、NF-κB表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示 ICAM-1、NF-κB的表達可能是急性痛風性關節炎炎癥反應誘因。扶他林軟膏組、蠲痹歷節清酊組與模型組ICAM-1、NF-κB表達比較降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示扶他林軟膏、蠲痹歷節清酊具有抑制大鼠急性痛風性關節炎模型中ICAM-1、NF-κB表達的作用。扶他林軟膏組與蠲痹歷節清酊組ICAM-1、NF-κB 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示扶他林軟膏與蠲痹歷節清酊在抑制急性痛風性關節炎模型ICAM-1、NF-κB表達中效果相當。綜上所述，蠲痹歷節清酊具有緩解急性腫脹、改善滑膜組織炎癥反應、抑制痛風性關節炎關節滑膜中ICAM-1、NF-κB的表達，從而減輕痛風性關節炎關節局部的炎癥癥狀的作用。

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Effects of Juanbi Lijieqing Tincture on ICAM-1,NF-κB Expression of Synovial Tissue in Model Rats with Acute Gouty Arthritis

LU Xiaolong1,ZENG Peng1,XIANG Lili1,XIONG Hui2*,QI Xinyu2,GUO Yuxing1,ZHOU Biao2
(1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410005,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo explore the effect mechanism of Juanbi Lijieqing tincture on the model rats with acute gouty arthritis.MethodsThe 40 SPF level healthy male SD rats were divided into Juanbi Lijieqing tincture group,Futaling ointment group,model group,blank control group,10 rats in each group.The former three groups were established acute gouty arthritis model,and intervened by Futalin ointment and Juanbi Lijieqing tincture.Rats were observed after modeled in general condition,then compared.The ankle swelling of rats after drug intervention was detected by the line method;the ankle synovial pathological changes were observed under light microscope;the ankle joint synovial tissue intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1),and nuclear-transcription factor-κB (NF-κB)in rats were determined by immunohistochemical staining method.ResultsThe swelling degree of Futalin ointment group and Juanbi Lijieqing tincture group,compared with the control group(P＜0.05).The synovial tissue structure in the blank group was neat and clear under the light microscope,while the synovial tissue structure in model group was disorder,synovial hyperemia,edema,and a large number of infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblast,a small amount macrophage infiltration were also obseved in the model group;Futalin ointment group and Juanbi Lijieqing tincture group showed obvious improvement,compared with the model group.The expression of ICAM-1 and NF-κB between the blank control group,Futalin ointment group and Juanbi Lijieqing tincture group with the model group were significantly different (P＜0.05).ConclusionJuanbi Lijieqing tincture shows the effects of relieving swelling,improving synovial inflammation,inhibiting the expression of ICAM-1 and NF-kB in the synovial membrane of the joint.

Juanbi Lijieqing tincture;gouty arthritis;ICAM-1;NF-κB

R285.5；R684.3

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.12.001

本文引用：陸小龍，曾 朋，向黎黎，熊 輝，齊新宇，郭玉星，周 彪.蠲痹歷節清酊對大鼠急性痛風性關節炎模型滑膜組織中ICAM-1、NF-κB表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（12）：1299-1302.

2017-04-26

國家自然科學基金（81574005）；湖南省自然科學基金（2015JJ6083）；湖南省教育廳科研項目（13C680）。

陸小龍，男，博士，副主任醫師，研究方向：骨病、筋傷的中醫藥防治研究。

*熊 輝，男，主任醫師，教授，博士研究生導師，E-mail：xh_hn@sina.com。

（本文編輯 楊 瑛）