茜草，茜草炭對(duì)血瘀大鼠肺組織中SOD、MDA、NO、NOS的影響

王侃

摘要：目的通過SOD、MDA、NO、NOS指標(biāo)評(píng)價(jià)茜草、茜草炭對(duì)急性血瘀大鼠肺組織的影響。方法以SD大鼠為研究對(duì)象，測(cè)定其SOD、MDA、NO、NOS四項(xiàng)指標(biāo)觀察茜草生、茜草炭對(duì)血瘀大鼠肺組織的影響。結(jié)果模型組比空白組MDA上升，SOD下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茜草組與模型組比較MDA下降，SOD活性上升。茜草炭與模型組比較MDA上升，SOD無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組與空白組比較NO、TNOS、cNOS含量均減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茜草組與模型組比較NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭組NO含量有一定的減少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。

關(guān)鍵詞：茜草；茜草炭；肺組織

茜草系茜草科植物茜草（Rubiacordifolia L.）的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。其味苦，性寒，無毒。主寒濕風(fēng)，痹，黃疸，補(bǔ)中，止血，內(nèi)崩，下血，膀胱不足，踒跌，蠱毒。久服益精氣輕身。可以絳染。一名地血，一名茹藘，一名茅蒐，一名蒨。生喬山川古。二月、三月采根，曝干。畏鼠姑[2]。

現(xiàn)臨床茜草常用于治療慢性肺出血，咳嗽出血。急性血瘀模型大鼠肺部出血癥狀明顯[3]，所以本實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠急性血瘀模型。用以評(píng)價(jià)茜草生品、炭品對(duì)急性血瘀大鼠凝血機(jī)制的異同。

由前期肺組織顯微觀察可知急性血瘀的模型大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，給藥組對(duì)肺組織修復(fù)的側(cè)重點(diǎn)不同，炭品主要減輕出血癥狀，生品主要修復(fù)肺組織結(jié)構(gòu)，減少炎癥細(xì)胞。為了探討急性血瘀大鼠是否是由于氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)引起的肺部損傷及進(jìn)一步探討茜草、茜草炭在治療血瘀癥時(shí)的差異。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從大鼠肺組織的MDA/SOD水平及NO，NOS水平來探討茜草的生熟異用。

1 材料

1.1動(dòng)物

SD大鼠50只，雌性，體重200-240g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 藥品與試劑

SOD、MDA、NO、NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所），枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)：20051005），鹽酸腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1009041）。云南白藥（云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20090116），藥材均購自于安徽銅陵藥材有限公司。

1.3 儀器

Anke-LXJ-11B 離心機(jī)（上海安壽科學(xué)儀器廠）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）

1.4供試液的制備

空白對(duì)照組0.5%CMC-Na溶液。

陽性對(duì)照組（云南白藥組）因云南白藥臨床用量為2g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按臨床用量20倍給藥，即0.227g/kg。實(shí)驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將云南白藥混勻并稀釋至所需濃度。

茜草生品組購于安徽銅陵（批號(hào)100326），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根及根莖。參照其臨床用量10g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按臨床用量20倍給藥，即5g生藥/kg。取適量茜草生品，適當(dāng)粉碎后過200目篩。取適量粉末，加入0.5%CMC-Na研磨均勻，并配制成所需濃度。

茜草炭則是將所購生品按2010年版《中國(guó)藥典》一部茜草炭炮制方法炒至表面焦褐色，內(nèi)部焦黃色的自制炭品。參照其臨床用量10g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按臨床用量20倍給藥，即5g生藥/kg。取適量茜草生品，適當(dāng)粉碎后過200目篩。取適量粉末，加入0.5%CMC-Na 研磨均勻，并配制成所需濃度。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。方差齊時(shí)選擇t檢驗(yàn)結(jié)果，方差不齊時(shí)選擇校正t檢驗(yàn)結(jié)果，以此比較模型組與各給藥組之間的顯著性差異。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品制備

取大鼠50只，雌性，體重220（±20）g，隨機(jī)分為7組，分別為空白組，模型組，云南白藥組0.27g/kg、茜草生品組5g/kg、茜草炭品組5g/kg，每組10只。正常組與模型組ig0.5%羧甲基纖維素鈉溶液2mL·100g-1，其余組ig等體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)7d。第6d給藥后禁食，除空白組外，其余組背部sc鹽酸腎上腺素1mL·kg-1，共2次，中間間隔4h，并在第1次sc4h后將大鼠浸入0～2℃冰水冰浴5min，復(fù)制急性血瘀大鼠模型[1]，正常組sc等體積的生理鹽水。將其處死，進(jìn)行解剖取下肺，按照重量/體積比例加入9倍的0.9%生理鹽水制成肺組織勻漿，低溫低速離心10 min（3000r/min），取上清液，-20℃保存待測(cè)生化指標(biāo)。

2.2肺組織SOD、MDA、NO、NOS合酶的含量測(cè)定[4]

2.2.1組織蛋白含量

測(cè)定原理：蛋白質(zhì)具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)或樣品中，考馬斯亮蘭上的陰離子與蛋白-NH3+結(jié)合，用酶標(biāo)儀測(cè)定其含量。

2.2.2 SOD活血測(cè)定：

測(cè)試原理：通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)生超氧化陰離子自由基（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)出紫紅色，通過酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度。通過公式計(jì)算出SOD活性。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1

計(jì)算公式：

2.2.3 MDA活性測(cè)定

測(cè)試原理：過氧化脂降解產(chǎn)物中的MDA可以硫代巴比妥酸縮合，形成紅色的產(chǎn)物，經(jīng)酶標(biāo)儀在532nm下測(cè)定。通過公式計(jì)算出MDA活性。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1。endprint

計(jì)算公式：

2.2.4 NO含量的測(cè)定

測(cè)試原理：NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)迅速代謝轉(zhuǎn)變?yōu)镹O2-和NO3-，而NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-。利用硝酸還原酶特異性的將NO3-還原成NO2-，根據(jù)顯色原理通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度以測(cè)定濃度。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表2。

計(jì)算公式：

2.2.5 NOS活性測(cè)定

測(cè)定原理：NOS可以催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親和性物質(zhì)反應(yīng)生成在530nm下顯色的化合物，用酶標(biāo)儀測(cè)定NOS活力。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表2。

計(jì)算公式：

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。方差齊時(shí)選擇t檢驗(yàn)結(jié)果，方差不齊時(shí)選擇校正t檢驗(yàn)結(jié)果，以此比較模型組與各給藥組之間的顯著性差異。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠肺組織中MDA、SOD的變化。

結(jié)果顯示模型組比空白組MDA上升，SOD下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茜草組與模型組比較MDA下降，SOD活性上升。茜草炭與模型組比較MDA上升，SOD無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與模型組比較，*p<0.05

3.2 大鼠肺組織中NOS、NO的變化

模型組與空白組比較NO、TNOS、cNOS含量均減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茜草組與模型組比較NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭組NO含量有一定的減少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。結(jié)果見表2。

注：與模型組比較，*p<0.05，

4討論

丙二醛（MDA）是機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸所產(chǎn)生的一種脂質(zhì)過氧化物。SOD是一種體內(nèi)能夠清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的一種酶。一氧化氮是（NO）在血液系統(tǒng)起著信使因子的作用。NO能夠維持血管張力的恒定與調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定作用。當(dāng)血液系統(tǒng)紊亂時(shí)NO的含量將會(huì)異常。體內(nèi)NOS有結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）2種。cNOS先天性存在，生成NO數(shù)量較少，產(chǎn)生迅速。iNOS在生理情況下基因不表達(dá)，當(dāng)受到某些細(xì)胞因子、病原微生物或腫瘤細(xì)胞刺激后，即被激活，大量產(chǎn)生iNOS，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。其中cNOS催化的NO肺組織粘膜有保護(hù)作用，而iNOS催化的NO機(jī)體有殺傷毒性及促炎作用[5]。

急性血瘀導(dǎo)致了肺組織發(fā)生了病變，模型組中SOD活性下降，MDA含量增加。說明氧自由基通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)參與了急性血瘀的發(fā)病過程。而茜草組急性血瘀大鼠肺組織中MDA含量降低，SOD活性升高，說明其能夠通過清除氧自由基，減少過氧化脂質(zhì)生成。從而治療急性血瘀引起的肺組織損傷。模型組中NO含量降低，可能是由于組織中含氧水平較高，NO可和O2-反應(yīng)生成生成ONOO-，對(duì)機(jī)體有毒害作用。而茜草組NO含量增加對(duì)血管起到擴(kuò)張保護(hù)作用，從而化瘀。而由于茜草炭的肺組織中SOD處于較低水平，而MDA含量增加，推測(cè)此時(shí)機(jī)體類的氧含量仍處于較高水平，使得茜草炭品組NO含量降低。模型組與空白組相比誘導(dǎo)型iNOS含量增加，iNOS含量的增加可能是導(dǎo)致肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的原因之一。茜草給藥組結(jié)構(gòu)型cNOS含量增加，對(duì)肺組織粘膜有保護(hù)作用。

所以筆者認(rèn)為茜草生品、炭品對(duì)機(jī)體的作用的機(jī)制有很大差異，并不能一味的認(rèn)為當(dāng)出血增多時(shí)茜草炭品便可替代生品應(yīng)用于臨床。

參考文獻(xiàn)

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