小麥中赭曲霉毒素A含量測定方法的改進研究

[摘要]目的：優化GB 5009.96-2016中赭曲霉毒素A檢測的前處理方法和色譜條件，以適應大批量樣本的檢測。方法：樣品經甲醇：水（V：V=80：20）漩渦提取、免疫親和層析凈化，超高效液相色譜法測定。色譜條件為Thermo Scientific Hypersil GOLD C18反相柱（100mm×2.1mm，粒徑1.9μm），流動相為1%乙酸水-乙腈（V：V=60：40），流速為0.25mL/min，進樣量4μL，柱溫：25℃，熒光檢測激發波長333nm，發射波長460nm。結果：赭曲霉毒素A在1.00～20.00ng/mL時具有良好的線性關系，相關系數R2=0.999 7，加標回收率為82.9%～90.1%，精密度RSD5.1%～6.1%。本方法實驗用時和流動相用量分別比國標法減少72.8%和87.5%。結論：本方法適用于小麥中赭曲霉毒素A含量的測定且更靈敏、高效和環保。在大批量樣品分析中可有效節約時間、材料成本。

[關鍵詞]小麥；赭曲霉毒素A；超高效液相色譜；免疫親和柱；漩渦提取

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180114

赭曲霉毒素A（Ohratoxin A，OTA）主要由曲霉屬、青霉屬等真菌污染產生，在谷物中的污染率和污染水平最高，具有肝腎毒性。我國食品安全國家標準中真菌毒素的限量值為5.0μg/kg。

目前用于赭曲霉毒素A定量分析的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜質譜聯用法、酶聯免疫法、薄層色譜法、免疫膠體金法和免疫親和柱法等，GB 5009.96-2016采用了免疫親和層析凈化-高效液相色譜法、離子交換固相萃取柱凈化-高效液相色譜法、免疫親和層析凈化-液相色譜串聯質譜法、酶聯免疫吸附測定法和薄層色譜測定法共5種方法。其中，酶聯免疫吸附測定法和薄層色譜測定法操作復雜；液相色譜法中普通高效液相色譜法耗時長、乙腈和甲醇試劑消耗大，液相色譜串聯質譜法檢測需要高端質譜儀；提取用均質器清洗費時費力且容易造成樣品交叉污染；搖床振蕩提取需耗時約30min；磷酸鹽緩沖液配制繁雜等限制了檢測工作效率的提升。

本次采用GB 5009.96-2016中對樣品有針對性的純化作用、過柱后可直接用于上機分析的免疫親和層析凈化法，同時對小麥中赭曲霉毒素A的提取方法、檢測儀器和色譜條件進行了改進：①用甲醇，水（V：V=80：20）替代磷酸鹽緩沖液；②用漩渦提取替代均質/振蕩；③探索建立小麥中赭曲霉毒素A免疫親和層析凈化-超高效液相色譜法（UPLC），以期獲得靈敏、高效、快速和環保的方法滿足大批量檢測的需要。

1材料與方法

1.1材料與試劑

糧庫中自然產生的赭曲霉毒素A陽性小麥；赭曲霉毒素標準溶液50μg/mL（苯：乙酸=99：1）：美國Supelco；甲醇（色譜純）：美國Fisher；乙腈（色譜純）：Sigma Mofich；冰乙酸、甲醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水經Sartorius純水機制備，0.22μm膜過濾。

1.2儀器

超高效液相色譜儀Thermo U3000+（配FLD檢測器及自動進樣裝置）：美國Thermo Fisher公司；旋渦混合器：韓國Daihan公司；實驗磨（孔徑：20目）：瑞典Perten公司；純水超純水系統：德國Sartorius公司；電子天平（分度值0.01g）：Mettler Toledo公司；玻璃纖維濾紙（Grade 934-AH，孔徑1.5μm）：Whatman公司；赭曲霉毒素A免疫親和柱：北京華安麥科生物技術有限公司；有機微孔濾膜（孔徑0.22μm）：Biosharp Life sciences公司。

1.3 UPLC分析條件

色譜條件為Thermo Scientific Hypersil GOLD C 1 8反相柱：100mm×2.1mm，粒徑1.9μm；流動相：1%乙酸水-乙腈（V：V=60：40、），流速：0.25mL/min，進樣量：4μL；柱溫：25℃；熒光檢測器，激發波長333nm，發射波長460nm。

1.4赭曲霉毒素A標準工作液的配制

用甲醇（色譜純）作溶劑，配制濃度分別為1.25、2.5、3.75、5ng/mL赭曲霉毒素A的標準工作液。

1.5樣品的制備

用實驗磨將赭曲霉毒素A陽性小麥樣品粉碎，稱取5.00g于離心管中，加入1.00g氯化鈉和25mL甲醇：水（V：V=80：20）提取液，旋渦混合4min，8000r/min離心10min，取上清液10mL，加入40mL水，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，收集25mL濾液過免疫親和柱凈化，用1mL甲醇：乙酸（V：V=49：1）洗脫，經0.22μm微孔濾膜過濾后進行超高效液相色譜分析。結果計算：

式中：X為試樣中赭曲霉毒素A的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；ρ為試樣測定液中赭曲霉毒素A的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V為試樣測定液最終定容體積，單位為毫升（mL）；1000為單位換算常數；m為試樣的質量，單位為克（g）；F為稀釋倍數。

2結果與分析

2.1標準工作曲線

赭曲霉毒素A標準品色譜圖見表1及圖1，保留時間為8.033min。以赭曲霉毒素A含量為橫坐標，峰面積為縱坐標建立標準工作曲線見圖2。

2.2樣品譜圖

按上述方法處理赭曲霉毒素A陽性小麥試樣，赭曲霉毒素A色譜圖見圖3，保留時間為7.857min。

2.3精密度

取上述赭曲霉毒素A陽性小麥試樣重復測定6次，計算精密度，結果見表2。

由表2可知，該方法赭曲霉毒素A的RSD為5.99（<15%），滿足分析方法的精密度要求。

2.4加標回收率

按表3添加20ng/mL赭曲霉毒素A標準溶液于5.00g上述赭曲霉毒素A陽性小麥試樣（赭曲霉毒素A含量0.9184μg/kg）中，每個濃度做5個平行，混勻，室溫保存過夜，測定方法回收率，結果見圖3。

由表3可知，上述條件的加標回收率為82.9%～90.1%，RSD為5.1%～6.1%，表明測定方法有較好的可行性和準確度。

2.5與國標方法比較

用國標的振蕩提取法提取一個樣品約30min，用本研究的漩渦提取法約4min，用時減少86.7%，更高效、快速。

用國標的高效液相色譜法測一個樣品約16.0min，消耗乙腈8mL，用本研究的超高效液相色譜法約8min，消耗乙腈1.0mL，用時減少50%，用量減少87.5%，更節約、更環保。

3結論

文章優化了GB 5009.96-2016中赭曲霉毒素A檢測的前處理方法和色譜條件，用甲醇：水（V：V=80：20）替代磷酸鹽緩沖液，采用更高效、便捷的漩渦法提取樣品中赭曲霉毒素A；建立了免疫親和層析凈化一超高效液相色譜法，可減少實驗用時72.8%，減少流動相用量87.5%，方法在1.00～20.00ng/mL時有良好的線性關系，相關系數R₂=0.9997，加標回收率82.9%～90.1%，精密度RSD5.1%～6.1%，適用于小麥中赭曲霉毒素A含量的測定且更靈敏、高效和環保。在大批量樣品分析中可有效節約時間、材料成本，具有實際應用價值。