種曲接種量對醬油制曲及發酵的影響

黃佳玲，劉建華，劉艷梅，蘇燕文

（廣東廚邦食品有限公司，廣東陽江 529500）

醬油釀造主要包含制曲與發酵兩大過程，制曲過程是醬油釀造的重要環節。米曲霉在制曲過程中發揮著重要作用，其分泌產生的各種酶，為醬油發酵的原料分解、物質轉化合成奠定了基礎[1]。醬油制曲過程中蒸料時間、米曲霉接種量、制曲溫度、制曲時間對成曲品質指標（蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力）均具有影響，其中接種量對蛋白酶比活力的影響最大[2]。醬油制曲用的米曲霉一般是由其母種經過3～4代擴大培養而來，統稱為種曲。種曲是醬油生產制曲的種子，種曲制作的主要目的是為醬油生產提供大量種子，即孢子[3]。但不同菌株產孢子能力不同，即使使用相同菌株培養所得的種曲，其孢子數也有很大不同[4]。實際生產中，為便于生產操作控制落實，制曲過程接入種曲時，往往是以培養種曲用的對應干物料的重量計算種曲重量，此時接入的種曲量雖相同，但不同培養工藝培養所得種曲本身的干基孢子數仍存在較大差異，會導致制曲接入的有效孢子數差異較大，進而可能會導致不同批次間制曲的質量產生較大波動，不利于產品品質的穩定。因此，需要找到制曲過程中種曲（米曲霉孢子）有效接種量的最優控制水平，用以控制生產并提升產品的質量與穩定性。

本文采用不同米曲霉孢子有效接入量進行醬油制曲與發酵，跟蹤監測不同時間曲料感官、制曲酶活的高低及不同時間發酵過程中常見理化指標，以期為企業大生產中的種曲接種量的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

菌種，廣東廚邦食品有限公司自培米曲霉三角瓶菌種；制曲與發酵過程所用原材料麩皮、黃豆、小麥、食用鹽，均從市場采購。

1.2 儀器與設備

IKA RH磁力攪拌器，廣州綠百草科學儀器有限公司；25×16血球計數板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；KDC-2C型微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀，英國柏楉有限公司；200 kg種曲機，江蘇華暉環保科技有限公司；發酵池，廣東廚邦食品有限公司設計自制；65 m3發酵罐，連云港中復連眾復合材料集團有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種曲培養方法

麩皮原料直接均勻按1.0～1.5 cm的厚度裝滿曲盤后，放入種曲機；以180～200 mL·min-1的噴水量補濕25～30 min，同步開啟種曲機風機；啟動種曲機的自動滅菌與冷卻功能，自動通入蒸汽升溫至120～125 ℃，保壓滅菌25～30 min對麩皮培養基進行滅菌，而后自動冷卻使培養基的溫度降至35～40 ℃；接入（6±2）‰的三角瓶菌種，并同步開啟種曲機風機20～30 min，接種完畢；控制加濕噴頭的噴水量在270～300 mL·min-1對接種后的培養基加濕（120±5） min，同步開啟種曲機風機；通過種曲機的自動培養程序進行自動控溫、加濕和通風，同時整個培養過程中種曲機風機需保持一直開啟。其中，培養溫度為28～36 ℃，通風量為5～7 m3·h-1，以180～200 mL·min-1的噴水量間斷性加濕培養至72 h，最終培養獲得成熟種曲[5]。

1.3.2 種曲有效接種量對醬油制曲的影響

將按1.3.1種曲培養方法培養所得的種曲依據其干基孢子數折算為60億個/g、80億個/g、100億個/g、120億個/g和140億個/g不同干基孢子數的種曲（折算方法詳見表1），再統一以3‰（W/W）的接種量將折算后種曲接入制曲原料進行大曲培養。其間，培養至第15～16 h進行第一次翻曲，繼續培養至第21～24 h進行第二次翻曲，培養至44 h獲得成熟大曲[6]。每組試驗需記錄第一、二次翻曲時曲料與成熟大曲的感官狀態，并以其感官、大曲中性蛋白酶活為判定依據，初步確定制曲適宜的種曲有效接種量。

表1 不同干基孢子數種曲的折算方法

1.3.3 種曲有效接種量對醬油發酵的影響

將1.3.2試驗中初步確定的制曲適宜的種曲有效接種量對應組別的成熟大曲分別與2.2倍20%的鹽水混合制醪，以相同投料量和投料時間分別投入65 m3發酵罐，參照廣式高鹽稀態醬油釀造的常規工藝進行發酵。在發酵至10 d、20 d、30 d、60 d、90 d和120 d，分別取其發酵液檢測總酸、氨基酸態氮、全氮、還原糖等常規指標進行跟進驗證，再結合1.3.2試驗結果進一步確認制曲適宜的種曲有效接種量。

1.3.4 在廣式高鹽稀態醬油釀造工藝中的應用試驗

以成熟大曲的感官、中性蛋白酶活及其90 d發酵液氨基酸態氮與全氮為主要指標、90 d發酵液總酸、還原糖為參考指標，驗證1.3.2與1.3.3共同確認的種曲有效接種量應用于廣式高鹽稀態醬油釀造工藝中制曲與發酵的穩定性。按照1.3.1種曲培養方法制備種曲，再按照1.3.2的制曲工藝制備成熟大曲（制曲接種量按照1.3.2與1.3.3共同確認的種曲有效接種量執行），而后按照1.3.3的發酵工藝進行發酵，發酵至120 d取其發酵液進行檢測。上述試驗共開展10批次平行試驗，以驗證其在大生產中的穩定性。

1.3.5 數據測定方法

孢子數測定參照《孢子數測定法》（SB/T 10315—1999）[7]；中性蛋白酶活測定參照《蛋白酶活力測定》（SB/T 10317—1999）[8]；總酸含量參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB 12456—2021）[9]，采用第三法自動電位滴定法測定；氨基酸態氮含量測定參照《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009.235—2016）[10]；還原糖含量參照《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》（GB 5009.7—2016）[11]，采用直接滴定法測定。

2 結果與分析

2.1 種曲有效接種量對醬油制曲的影響

米曲霉的接種量對醬油制曲的質量，特別是其關鍵指標蛋白酶活有一定影響。在大生產中，制曲接入的種曲量相對固定，但當種曲的孢子數不同時，其不同批次有效米曲霉孢子接入量亦不相同，可能會對制曲質量產生影響。試驗通過將種曲折算為不同干基孢子數的種曲，再按統一的接種量制曲（實際接入的有效孢子數不同），從而驗證確定制曲適宜的種曲有效接種量，試驗結果見表2。

表2 種曲有效接種量對醬油制曲影響的試驗結果

由表2可知，隨著制曲接種的折算后種曲干基孢子數的升高，米曲霉的生長速度逐步加快，開始產生孢子的時間亦有所提前，成熟大曲的孢子量明顯上升。當制曲接種的折算后種曲干基孢子數達到140億個/g時，米曲霉生長速度最快，在第二次翻曲時曲料的孢子量已到達生產可接受水平的上限，而成熟大曲感官孢子豐滿、孢子量遠超出生產可接受水平；當制曲接種的折算后種曲干基孢子數在120億個/g及以下時，成曲孢子量最多為3個+的水平，均處于生產可接受水平。成熟大曲的中性蛋白酶活則整體呈現先快后慢的上升趨勢，在制曲接種的折算后種曲干基孢子數為120億個/g時，成熟大曲中性蛋白酶活達到最大值（2 757 U·g-1）；制曲接種的折算后種曲干基孢子數繼續提升至140億個/g時，成熟大曲中性蛋白酶活為2 682 U·g-1，略有下降。這可能是因為種曲有效接種量過大，會引起品溫上升相對較快，易結塊，不利于通風供氧，營養物質消耗過快，影響米曲霉的生長代謝，導致產酶量降低。結合生產經驗，暫定制曲適宜的種曲有效接種量為接種3‰折算為80～120億個/g干基孢子數的種曲。

2.2 種曲有效接種量對醬油發酵的影響

分別采用1.3.2試驗中制曲接種量為接種3‰折算后干基孢子數為80億個/g、100億個/g、120億個/g的種曲培養所得成熟大曲與鹽水混合制醪，而后發酵曬制，并跟進發酵過程中不同天數發酵液的總酸、氨基酸態氮、全氮、還原糖等評價發酵質量優劣的主要指標。

2.2.1 發酵過程總酸的動態變化

由圖1醬油發酵過程中總酸的動態變化可以看出，醬油發酵過程中，不同組別總酸含量均是在發酵前90 d快速上升，90 d時基本達到最高水平，而后維持在一個相對穩定的狀態。120 d總酸含量有小幅下降，可能是因為某些微生物可以將有機酸轉化為其他次級代謝產物[12]。總酸是醬油品鑒的風味物質，且與產品貨架期的體態穩定性相關，總酸過低會導致醬油體態不穩定，析出絮狀雜質或晶體，且影響醬油防腐效果；總酸過高會導致產品發酸，影響其風味的柔和性，并掩蓋發酵醬油本身的醬香味[13]。因此，結合生產經驗，種曲有效接種量優選為接種3‰折算為80億個/g、100億個/g干基孢子數的種曲。

圖1 醬油發酵過程中總酸的動態變化

2.2.2 發酵過程氨基酸態氮與全氮的動態變化

全氮是醬油中可溶性含氮化合物的總稱，包括原料溶出的蛋白質、發酵過程蛋白酶解產生的游離氨基酸、多肽氮、微生物自溶釋放的核酸類水解物等，是衡量原料利用率與醬油發酵品質的重要指標之一。氨基酸態氮則是指以氨基酸形式存在的氮，也是全氮的一部分，更是區分不同級別醬油的核心指標之一。發酵過程中氨基酸態氮與全氮的動態變化分別見圖2、圖3。

圖2 醬油發酵過程中氨基酸態氮的動態變化

圖3 醬油發酵過程中全氮的動態變化

由圖2、圖3可以看出，醬油發酵過程中，不同組別氨基酸態氮均呈現持續上升的趨勢，60 d后上升幅度逐漸變緩，發酵至120 d時，3組醬油的氨基酸態氮含量分別為1.03 g/100 mL、1.07 g/100 mL、1.07 g/100 mL，均達到國標中對特級醬油的要求。3組中，制曲接種的折算后種曲干基孢子數為100億個 /g與120億個/g的組別，其不同發酵天數的氨基酸態氮均高于制曲接種的折算后種曲干基孢子數為80億個/g的組別。3組醬油發酵液的全氮含量均呈現為在30 d前快速上升，30 d之后緩慢增加/維持相對穩定水平的趨勢，最終發酵結束時，3組醬油全氮含量分別為1.57 g/100 mL、1.58 g/100 mL、1.58 g/100 mL，3組全氮水平相當、無明顯差異。整體來看，制曲接種的折算后種曲干基孢子數為100億個/g與120億個/g的組別，發酵過程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，發酵結束時氨基酸態氮相對較高，但對全氮的最終積累無優勢。因此，種曲有效接種量優選為接種3‰折算為100億個/g、120億個/g干基孢子數的種曲。

2.2.3 發酵過程還原糖的動態變化

在發酵過程中，淀粉質原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解為還原糖，醬油的口感、風味、色澤等都與還原糖含量密切相關[14]。發酵過程中還原糖的動態變化見圖4。

圖4 醬油發酵過程中還原糖的動態變化

由圖4可以看出，醬油發酵過程中，3組醬油發酵液還原糖含量均呈現先上升后逐漸降低的趨勢，在發酵至第20 d時，3組醬油發酵液的還原糖含量均達到最大值，分別為6.70 g/100 mL、5.67 g/100 mL、5.35 g/100 mL。這主要是發酵前期淀粉酶等活力尚處于旺盛期，可以快速將淀粉質原料水解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，且此時還原糖的消耗速度較低，所以前期還原糖含量快速上升至最高值。20 d之后，隨著發酵的持續進行，乳酸菌、酵母菌等微生物逐漸發展為優勢菌群，將前期積累的還原糖進一步分解代謝為酸類、醇類、酯類等次級代謝產物，故而導致還原糖含量下降。發酵結束時，3組醬油的還原糖含量分別下降至5.10 g/100 mL、4.33 g/100 mL、3.25 g/100 mL，第3組醬油的還原糖含量最低，這可能是由于第3組的有效接種量最多，接種量過大導致制曲過程對淀粉質的消耗過多所致。結合產品品質控制的需求與生產經驗，種曲有效接種量優選為接種3‰折算為80億個/g、100億個/g干基孢子數的種曲。

綜合以上理化指標，3組中第2組醬油的各項指標均能達到生產所需的優選水平，因此可繼續以制曲接種3‰折算后干基孢子數為100億個/g的種曲進行后續應用試驗。

2.3 優選種曲有效接種量應用試驗

按照2.2中最終確定的優選種曲有效接種量在廣式高鹽稀態醬油釀造工藝中開展應用試驗，其試驗結果見表3。

表3 優選種曲有效接種量應用試驗結果

由表3可知，按照制曲接種3‰折算后干基孢子數為100億個/g的種曲進行醬油制曲與發酵應用試驗，其培養所得成熟大曲的整體感官菌絲豐滿、孢子量適中，均在生產可接受水平內，大曲中性蛋白酶活均在2 000 U·g-1以上的較高水平；所得的大曲進行醬油發酵時，其120 d醬油發酵液的總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮均值為1.59 g/100 mL，還原糖均值為4.45 g/100 mL，各項理化指標均能達到前期試驗的優選水平及以上，整體質量水平優良穩定。

3 結論

本文考察了不同種曲（米曲霉孢子）有效接種量對醬油制曲與發酵的影響，結果表明，隨著種曲有效接種量的提升，在制曲時，成熟大曲的中性蛋白酶活整體呈先上升后穩定的趨勢，接種量提升能夠促進米曲霉加快生長，但提升較多會導致制曲過程產孢子時間大大提前，甚至成熟大曲的孢子量超出生產可接受水平，就生產而言，孢子數過多可能影響工人操作，同時也不便于后期清潔[15]。在試驗范圍內，種曲有效接種量相對較低的試驗組，發酵結束時，其總酸與還原糖含量相對較高，能夠達到生產較優水平；而種曲有效接種量相對較高時，發酵過程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，特別是發酵前期，發酵結束時氨基酸態氮的積累量相對較高，但對全氮的最終積累量無優勢。綜合來看，種曲有效接種量優選為制曲接種3‰折算后干基孢子數為100億個/g的種曲。使用該種曲有效接種量進行制曲，培養所得大曲的中性蛋白酶活可穩定達到2 000 U·g-1以上的較高水平，且不會出現成熟大曲孢子量超出生產可接受水平的問題；進一步制醪發酵至120 d時，獲得的醬油總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮含量均值為1.59 g/100 mL，還原糖含量均值為4.45 g/100 mL，醬油品質能夠達到國標中的特級醬油標準，品質優良。

為了生產便利，設定制曲原料總質量為Z，將種曲有效接種量優選為制曲接種3‰折算后干基孢子數為100億個/g的種曲進行換算，即制曲接種時適宜的種曲使用量W=Z×3‰×100÷S（S為使用的種曲的干基孢子數）。如此，針對不同培養工藝/不同批次干基孢子數差異大的種曲，使用時直接套用上述公式計算出對應的種曲使用量進行接種，就可以確保制曲接入的種曲量不同，但接入的孢子量相同，從而提升了制曲的質量與穩定性，為不同培養工藝的種曲與同工藝孢子數差異較大的不同批次種曲在企業大生產中的種曲接種量控制提供了一種參考方案。