瑤藥四方鉆的化學成分研究

韋 范，王 碩，周小雷，卞 理，龔小妹，歐春麗

(1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西南寧 530023；2.廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530023；3.西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，廣西南寧 530023)

四方鉆是葡萄科白粉藤屬植物戟葉白粉藤[(Cissushastata(Miq. ) Planch]的藤莖,別名四方藤、紅四方藤、風藤、軟筋藤，生于山谷林下，產于廣西南寧、隆安、龍州、防城、博白、岑溪、賀州、金秀、等縣市，分布于廣東、臺灣等省份。四方鉆味澀，微苦，甘，性平，具有去癖生新、舒筋活絡、筋絡拘攣的功效，既可用于治療腰肌勞損、風濕痹痛、內外傷出血、跌打損傷、疼痛、胃及十二指腸出血等癥，又可用于產后保健藥浴[1]。研究表明，四方鉆中含有巖白菜素、11-O-沒食子酰巖白菜素等成分[2]。為更全面挖掘四方鉆的化學成分，筆者采用硅膠色譜法和聚酰胺色譜法分離純化，并根據化合物理化性質和核磁共振結構數據進行化合物結構鑒定。

1 材料與方法

1.1儀器600兆核磁共振儀(美國VARIAN公司)；X-4數字顯示微熔點測定儀(熔點未校正)； LC-MS(美國VARIAN公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；GF254硅膠板(青島海洋化工分廠)；柱層層析硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工廠)。

1.2材料與試劑四方鉆藥材購于廣西金秀縣，由廣西壯族自治區藥用植物園趙以民博士鑒定為葡萄科白粉藤屬植物戟葉白粉藤[(Cissushastata(Miq.)Planch]的藤莖。藥材樣品存于廣西藥用植物園。色譜用試劑均為分析純。

1.3方法四方鉆藥材50 kg粉碎，用8倍量80%乙醇超聲提取1 h，提取3次，提取液回收，蒸至無醇味，得6.5 kg浸膏，以水混懸用乙酸乙酯萃取(乙酸乙酯∶水=1∶1)，萃取液蒸干得膏630 g。取394 g浸膏，甲醇溶解，與100～200目硅膠按1.00∶1.14的比例拌勻，揮干溶劑，以樣品量與硅膠量(200～300目)1∶5比例用純石油醚濕法裝硅膠柱，干法上樣。以石油醚∶乙酸乙酯(1∶0、9∶1、8∶1、6∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，最后甲醇沖柱，每2 500 mL為一個流份，收集流份，根據薄層層析結果合并各流份，得P1-P6流份，將所得流份經反復硅膠、凝膠、小孔樹脂等柱層析方法分離得到各單體化合物。P2回收溶劑后，在石油醚-乙酸乙酯(9∶1)洗脫部位有白色晶體析出，經氯仿甲醇溶解重結晶，硅膠柱色譜分離，Sephadex LH-20柱分離后依次得到白色片狀結晶C和白色結晶B；P3經石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脫部位經硅膠柱色譜分離(50 g)，反復經過Sephadex LH-20柱分離純化得到白色粉末A；P5經石油醚-乙酸乙酯(1∶1)洗脫部位經硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇(8∶1、6∶1、4∶1)梯度洗脫，再反復經過Sephadex LH-20柱，以氯仿-甲醇(1∶1)為洗脫劑，純化，得到白色結晶D和E；P6經回收溶劑后，純乙酸乙酯部位有透明棱柱狀晶體析出，記為F。經硅膠柱，氯仿-甲醇(5∶1、4∶1、3∶1)梯度洗脫，再反復經過Sephadex LH-20柱，以氯仿-甲醇(1∶1)為洗脫劑，純化，又得另一白色粉末G和一白色晶體H。

2 結果與分析

2.1化合物A白色粉末(甲醇)，mp：283～285 ℃，易溶于吡啶，溶于甲醇、乙醇，略溶于丙酮，微溶于氯仿和乙醚，不溶于水和石油醚。ESI-MSm/z(%)：479[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，MeOD)δ(ppm)：5.51(1 H，m，H-12)、3.47(1 H，m，H-3)、2.66(1 H，br，d，J=11.3 Hz，H-18)。13C-NMR(C5D5N，150 MHz)δ(ppm)：37.7(C-1)、26.7(C-2)、76.7(C-3)、38.0(C-4)、54.4(C-5)、17.4(C-6)、32.2(C-7)、38.6(C-8)、46.6(C-9)、35.1(C-10)、22.3(C-11)、124.2(C-12)、137.8(C-13)、41.1(C-14)、27.3(C-15)、23.3(C-16)、46.6(C-17)、52.1(C-18)、38.1(C-19)、38.0(C-20)、29.7(C-21)、36.0(C-22)、27.4(C-23)、14.3(C-24)、15.2(C-25)、16.0(C-26)、22.5(C-27)、178.4(C-28)、16.1(C-29)、17.4(C-30)。基于以上這些質譜數據與參考文獻[3]基本一致，因此確定該化合物為熊果酸。

2.2化合物B白色針狀結晶(氯仿-甲醇)，不溶于水，易溶于氯仿、甲醇等有機溶劑。薄層色譜在不同的溶劑體系中展開，均顯示為單點，mp：137～139 ℃。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ(ppm)：0.61(3 H，s，H-18)、0.74(3 H，d，J=7.0 Hz，H-27)、0.76(3 H，d，J=6.8 Hz，H-26)、0.77(3 H，t，J=7.5 Hz，H-29)、0.85(3 H，d，J=6.5 Hz，H-21)、0.94(3H，s，H-19)、5.28(1 H，m，H-6)、3.45(3 H，m，H-3)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ(ppm)：36.2(C-1)、30.6(C-2)、70.8(C-3)、41.3(C-4)、139.7(C-5)、120.7(C-6)、30.9(C-7，8)、49.1(C-9)、35.1(C-10)、20.1(C-11)、38.8(C-12)、41.3(C-13)、55.8(C-14)、23.3(C-15)、27.2(C-16)、55.1(C-17)、11.0(C-18)、18.0(C-19)、35.5(C-20)、17.8(C-21)、32.9(C-22)、25.1(C-23)、44.8(C-24)、28.2(C-25)、18.4(C-26)、18.8(C-27)、22.1(C-28)、10.8(C-29)。以上數據與文獻[4-5]中報道的基本一致，將該化合物與β-谷甾醇標準品多溶劑系統展開，Rf值與標準品一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

2.3化合物C無色片狀晶體(氯仿)，mp：286～287 ℃，易溶于吡啶、氯仿，可溶于乙酸乙酯、石油醚，微溶于丙酮、甲醇。ESI-MSm/z(%)：425[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 M Hz)δ(ppm)：0.66(3 H，S，H-18)、0.84(3 H，d，J=7.1 Hz，H-27)、0.86(3 H，d，J=5.3 Hz，H-26)、0.88(3 H，t，J=7.4 Hz，H-29)、0.98(3 H，d，J=6.4 Hz，H-21)、5.05(1 H，d，J=7.7 Hz，H-1’)、5.35(1 H，m，H-6)、4.56(1 H，m，H-3)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz) δ(ppm)：38.3(C-1)、34.1(C-2)、217.5(C-3)、47.5(C-4)、55.7(C-5)、19.9(C-6)、36.6(C-7)、37.5(C-8)、48.7(C-9)、35.7(C-10)、17.4(C-11)、33.5(C-12)、38.8(C-13)、157.5(C-14)、117.2(C-15)、37.66(C-16)、37.72(C-17)、48.8(C-18)、40.6(C-19)、28.8(C-20)、35.0(C-21)、33.1(C-22)、26.1(C-23)、21.5(C-24)、14.5(C-25)、29.9(C-26)、25.6(C-27)、29.8(C-28)、33.5(C-29)、21.3(C-30)。以上質譜數據與文獻[6-7]基本相符，因此鑒定化合物A為蒲公英賽酮。

2.4化合物D白色針狀結晶(甲醇)。TLC用不同溶劑體系展開，均顯示為單點。mp：238.0～239.5 ℃。ESI-MSm/z(%)：171[M+H]+。1H-NMR(MeOD，600 MHz)δ(ppm):7.04(2 H，s，H-2，6)。13C-NMR(MeOD，150 MHz)δ (ppm):121.9(C-1)、110.2(C-2，6)、146.3(C-3，5)、139.5(C-4)、170.4(-COOH)。以上數據與文獻[8]基本一致，確定該化合物為沒食子酸。

2.5化合物E白色針狀結晶(甲醇)，難溶于水，易溶于氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。C14H12O3，mp:257～259 ℃。ESI-MSm/z(%)：227[M-H]-。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ(ppm)：7.24(2 H，d，J=8.7 Hz，H- 2′，6′)、6.87(1 H，d，J =16 Hz，H-8)、6.71(1 H，d，J=16 Hz，H-7)、6.66(2 H，d，J =8.6 Hz，H-3′，5′)、6.35(2 H，d，J =2.2 Hz，H-2，6)、6.07(1 H，t，J=2.1 Hz ，H-4)。13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ(ppm)：141.5(C-1)、105.9(C-2，6)、159.8(C-3，5)、102.8(C-4)、130.6(C-1′)、128.9(C-2′，6′)、116.6(C-3′，5′)、158.5(C-4′)、129.5(C-7)、127.1(C-8)。以上數據與文獻[9]基本一致，確定該化合物為白藜蘆醇。

2.6化合物F無色棱柱狀結晶(氯仿-甲醇)，在甲醇中溶解，在水或乙醇中微溶，mp:232～240 ℃。ESI-MSm/z(%)：328[M]+。1H-NMR(MeOD，600 MHz)δ(ppm)：7.05(1 H，S，H-7)、4.94(1 H，d，J=10.2 Hz，H-10b)、4.05(1 H，m，H-4a)、3.88(3 H，s，OCH3)、3.71(1 H，m，H-4)、3.61(1 H，m，H-2)、3.72(1 H，m，H-11)、3.45(1 H，m，H-3)。13C-NMR(MeOD，150 MHz)δ(ppm):82.7(C-2)、71.4(C-3)、75.4(C-4)、81.5(C-4a)、165.8(C-6)、119.4(C-6a)、111.0(C-7)、152.1(C-8)、141.9(C-9)、149.5(C-10)、117.0(C-10a)、73.7(C-10b)、62.4(C-11)、61.0(-OCH3)。以上數據與文獻[10]基本一致，確定該化合物為巖白菜素。

2.7化合物G白色粉末(甲醇)，mp：286～287 ℃，溶于吡啶，微溶于丙酮和甲醇。ESI-MSm/z(%)：577[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ(ppm)：0.66(3 H，s，H-18)、0.84(3H，d，J=7.1 Hz，H-27)、0.86(3 H，d，J=5.3 Hz，H-26)、0.88(3 H，t，J=7.4 Hz，H-29)、0.98(3 H，d，J=6.4 Hz，H-21)、5.05 (1 H，d，J=7.7 Hz，H-1’)、5.35(1 H，m，H-6)、4.56(1 H，m，H-3)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz) δ(ppm)：36.1(C-1)、28.1(C-2)、77.1(C-3)、37.9(C-4)、139.5(C-5)、120.5(C-6)、30.8(C-7)、30.7(C-8)、48.9(C-9)、35.2(C-10)、19.9(C-11)、38.5(C-12)、41.0(C-13)、54.8(C-14)、23.1(C-15)、25.0(C-16)、55.4(C-17)、10.8(C-18)、18.6(C-19)、35.0(C-20)、17.6(C-21)、28.9(C-22)、32.8(C-23)、44.6(C-24)、25.0(C-25)、17.8(C-26)、18.0(C-27)、22.0(C-28)、10.6(C-29)、101.1(C-1’)、73.9(C-2’)、77.2(C-3’)、70.3(C-4’)、76.7(C-5)、61.4(C-6’)。以上數據與文獻[11-12]報道的基本一致。經過與胡蘿卜苷對照品共薄層顯色，在3種溶劑系統下展開行為一致，混合后測定熔點不下降，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

2.8化合物H白色針狀結晶(氯仿-甲醇)，mp：176～178 ℃。ESI-MSm/z(%)：480[M]+。1H-NMR(MeOD，600 MHz) δ(ppm)：7.11(2 H，s，H-2’，6’)、7.08(1 H，S，H-7)、5.03(1 H，d，J=10.2 Hz，H-10b)、4.80(2 H，m，H-11)、4.10(1 H，m，H-4a)、3.94(1 H，m，H-2)、3.89(3 H，s，OCH3)、3.84(1 H，m，H-4)、3.55(1 H，m，H-3)。13C-NMR(MeOD，150 MHz)δ(ppm)：81.3(C-2)、71.8(C-3)、75.4(C-4)、80.6(C-4a)、163.9(C-6)、119.4(C-6a)、111.2(C-7)、152.4(C-8)、142.3(C-9)、149.3(C-10)、117.0(C-10a)、74.4(C-10b)、64.6(C-11)、60.9(-OCH3)、119.8(C-1’)、110.2(C-2’,6’)、146.6(C-3’，5’)、140.1(C-4’)、168.2(-COOH)。以上數據與文獻[13-14]基本一致，確定該化合物為11-O-沒食子酰巖白菜素。

3 討論與結論

瑤族醫藥是我國傳統醫藥的重要組成部分，四方鉆是瑤族常用草藥。池翠云等[2]采用硅膠柱色譜、薄層色譜、重結晶等化學方法進行分離純化，從四方藤中分離并鑒定到β-谷甾醇、巖白菜素、11-O-沒食子酰巖白菜素、11-O-(4-hydroxy benzoyl) bergenin、沒食子酸以及胡蘿卜苷共6種化合物。該研究通過硅膠色譜、聚酰胺色譜分離純化，不僅得到上述6種化合物，另外還得到1種新的化合物——熊果酸，這是首次在四方鉆中報道該化合物。熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，很多研究表明，熊果酸及五環三萜同類物具有抗HIV、抗腫瘤、抗糖尿病、抗病毒、抗菌、增強免疫功能以及降血脂等生物學活性[15]。