長小蠹亞科類昆蟲分子鑒定技術研究進展

方文淵，吳志毅，*，張文俊，田宏偉，程 帆，黃凌哲，吳 穎，陳 哲，

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江杭州 311215；2.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江杭州 310016)

長小蠹類昆蟲隸屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)長小蠹亞科(Platypodinae)，該亞科昆蟲又稱“食菌小蠹”(ambrosia beetles)或“針孔小蠹”(pinhole beetles)，世界已知種類1 500余種[1-2]。該類害蟲主要為害樹木及木材[3]，在木質部內營鉆蛀寄生生活，蟲道縱橫交錯，蟲道內常有伴生菌，導致木材變質，嚴重影響木材質量，降低木材的使用價值，有些種類還可傳播樹木病害，加速植物死亡；其為害的寄主有些為豆科紫檀屬、黃檀屬等名貴樹木或木材，是一類具有重要經濟意義的林木害蟲。因長小蠹類昆蟲危害大，易通過人為傳播，擴散防治困難，對其的檢疫工作受到世界許多國家的重視。新西蘭、澳大利亞、日本、美國等國家均將長小蠹的部分類群確定為檢疫性有害生物。2007年我國發(fā)布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中，異脛長小蠹屬非中國種及長小蠹屬非中國種被確定為檢疫性有害生物。

20世紀以來，隨著國際貿易的不斷增長，長小蠹類昆蟲隨木材及木質包裝在世界各國擴散風險日益增大。日本檢疫部門從進境原木中截獲大量的長小蠹，并發(fā)現(xiàn)一些新種[4]。美國和加拿大檢疫部門從進境木材中截獲10余種長小蠹類有害昆蟲，部分種類已在北美地區(qū)定殖[5]。20世紀末期至今，國家對進口木材一直實行零關稅政策；同時我國對木材量需求逐年增長，近10余年來，我國原木、板材等木材進口量大幅增長，年均增長20%以上。隨著木材的大量進境，疫情檢出率逐年升高，在截獲的眾多有害生物中，長小蠹是截獲頻次較多的一大類林木害蟲，口岸檢驗檢疫部門每年都從進境木材中截獲大量的長小蠹，年均增長15%。同時長小蠹的一些種類具有很強的擴散入侵性。

隨著木材的大量進口，伴隨著大量的長小蠹昆蟲的發(fā)生，使我國森林生態(tài)和木材資源受到極大的威脅，造成巨額的損失，且該類害蟲的傳播、入侵能力較強，一旦入侵，將會對入侵地區(qū)產生嚴重危害。例如，原產非洲的平行長小蠹(Euplatypusparallelus)，后隨原木、木質包裝等傳入澳州和東南亞等國家和地區(qū)[2，6]，現(xiàn)已廣布于東南亞地區(qū)。柱體長小蠹(Platypuscylindrus)，原發(fā)生于歐洲少數(shù)國家，后來傳播擴散到歐洲大部分地區(qū)[7]。

目前，我國對國內外長小蠹類形態(tài)學系統(tǒng)分類鑒定、顯微形態(tài)鑒定等研究均較少，許多方面尚為空白。口岸植物檢疫部門在進境木材中截獲的該類昆蟲檢疫鑒定方面還較薄弱，對一些潛在危險性類群的檢疫鑒定還無法解決。植檢技術人員因相關檢疫鑒定資料專著、文獻等的缺乏，進境木材截獲的長小蠹類部分種類只能鑒定到科、屬級的水平。這種現(xiàn)狀對出入境檢疫部門進一步研究和掌握國外該類昆蟲中重要木材害蟲種類、危害性及防疫工作十分不利，影響對國外該類昆蟲潛在危險性種類科學、合理地確定。同時，由于長小蠹類的鑒定對分類專業(yè)水平要求高，且需長期從事檢疫鑒定積累經驗。因此，一種簡便而快速的檢疫鑒定方法對于該類害蟲的防治具有重要意義，查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術在昆蟲的分類鑒定中具有獨特的優(yōu)勢，因此，我們期望通過DNA條形碼技術對長小蠹類昆蟲進行快速檢疫鑒定。

1 DNA條形碼技術及原理

自林奈建立雙命名法以來，有170多萬種物種被命名，在此過程中形態(tài)學家需要付出極大的努力，而傳統(tǒng)物種鑒定方法存在一定的局限性。物種的表型可塑性、遺傳變異性、對專業(yè)知識的高要求性等，導致鑒定錯誤非常普遍。為了克服這些問題，學者們提出通過DNA對物種進行鑒定[8-11]。

2003年3月，美國冷泉港召開Taxonomy and DNA會議，在這次會議上，加拿大科學家Hebert 等[12-13]首次提出DNA Barcode的概念，即生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，自DNA條形碼技術被提出后，在短短幾年中大量的物種條形碼基因被測定。

眾所周知，A、T、C和G 4種堿基的排列構成基因的信息存于DNA中，每個位點都可以由這4種堿基組成，那么一條含有n個堿基組成的基因，可能形成的序列就有4n種。10億個物種編碼序列只需15個堿基就可以，雖然實際上堿基的排列并不是隨機排列，部分位點存在高度的保守性，但是從理論上可以確定一段幾百個堿基組成的序列也足以包含能夠鑒定該物種的信息[14]。

2003年加拿大科學家Hebert等[12]提出以線粒體細胞色素氧化酶亞基I(COI)基因5′端648 bp 的序列作為標準，建立DNA條形碼物種鑒定系統(tǒng)。Hebert等[12-13]通過對7個不同門的中100個物種進行分析，研究COI基因的組成，結果表明通過COI基因的系統(tǒng)發(fā)育分析可將96%的物種分類到正確的門中。此后又對地球上物種豐富度最高的六足綱進行同樣的分析[15]，選擇的研究對象為其中物種豐度最高的8目100屬，并表明指定的50個新分類群的正確順序。最后，他們通過對COI序列的測定，了解該基因對鱗翅目昆蟲正確鑒定的能力，由于在這個屬之間的序列差異最低。因此，對鱗翅目昆蟲物種鑒定具有極大的挑戰(zhàn)性，而且該目中昆蟲物種數(shù)最多。在這個測試中，涉及到200個親緣關系密切的物種，隨后分析結果對150個新物種進行鑒定，結果鑒定成功率為100%。自此，開啟了以COI作為物種鑒定標準的熱潮。

2 DNA條形碼技術在長小蠹及其他昆蟲中的應用

2.1DNA條形碼技術在長小蠹類昆蟲分類鑒定中的應用DNA條形碼技術在長小蠹類昆蟲的應用相對較少，國內外的相關研究報道也較少。王銀竹等[16]通過線粒體基因COI基因5’端的549 bp序列對長小蠹科5屬10種進行的系統(tǒng)進化研究，結果表明根據(jù)MP、ML及NJ構建的系統(tǒng)進化樹中，NJ樹顯示的進化關系與Wood等[2]及Bright[1]提出的最新長小蠹分類系統(tǒng)一致。歷史上長小蠹類昆蟲分類一直比較混亂，且分類地位也存在爭議，通過分子手段對長小蠹的研究表明，最新的分類系統(tǒng)與分子研究結果相一致。由于長小蠹類昆蟲的分子研究極其缺乏，對現(xiàn)有的分類系統(tǒng)的佐證缺乏大量的數(shù)據(jù)，因此對于DNA條形碼技術在長小蠹類昆蟲中的應用迫在眉睫。此外，王銀竹[17]通過反向雜交技術(PCR-RDB)對長蠹科及長小蠹科22種昆蟲進行快速檢疫鑒定研究。通過線粒體基因COI序列，構建特異性反向雜交探針，通過探針與特定序列的結合，實現(xiàn)9種長蠹、9種長小蠹及3種小蠹的快速鑒定，靈敏度達到pg級。

Jordal[18]對長小蠹科80種以及8個外類群進行系統(tǒng)進化研究，通過COI、EF-1a、CAD、ArgK和28S5個基因構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示Tesserocerini、Notoplatypus和Platypodini為3個姊妹群，且在進化中Tesserocerini和Notoplatypus最早出現(xiàn)分化；從進化樹中可以看出，各屬的關系比較混亂，并不能形成一個獨立的分枝，表明現(xiàn)有的分類并不能與分子鑒定結果形成統(tǒng)一的結論。由于長小蠹類昆蟲的分子數(shù)據(jù)匱乏，現(xiàn)有的分子數(shù)據(jù)與形態(tài)學分類結果存在較大的出入，因此對長小蠹分類研究我們還有許多工作需要完成，最終形成分子鑒定結果與形態(tài)特征相一致的結果。

2.2DNA條形碼技術在其他昆蟲中的應用對于昆蟲而言，線粒體基因COI為母系遺傳基因，作為系統(tǒng)發(fā)育研究的條形碼基因無疑可以滿足大部分昆蟲分類鑒定的需求。最初，COI基因中648 bp的基因被作為標準的條形碼基因用于物種鑒定，被廣泛的認可；隨后的研究中，發(fā)現(xiàn)COI基因5’端的100 bp片段在用于博物館樣品鑒定中也同樣具有很高的鑒定成功率[19]，最后，通過大量的研究證明該片段對于真核生物的鑒定中也同樣具有非常高的成功率。COI基因作為DNA條形碼基因被廣泛用于物種的鑒定，同樣也是評價生物多用性的分子手段。除了線粒體基因中的COI基因被廣泛用于物種鑒定外，線粒體基因中其他12個蛋白編碼基因，以及核糖體基因12sRNA和16sRNA也被用于物種的鑒定。

近年來，DNA 條形碼技術在等翅目[20]、鞘翅目[21]、蜻蜓目[22]、直翅目[23]、彈尾目[24]、蜉蝣目[25]等中均已開展。

2.3DNA條形碼的局限性任何一種方法都不可能是萬能的，DNA條形碼在物種鑒定方面有著得天獨厚的優(yōu)勢，同樣也存在它的局限性[26]。基于DNA的物種分類鑒定的方法是依據(jù)種間和種內遺傳變異，但是對于近期分化的新種鑒定顯得比較困難，而且也不存在一個通用基因或者單一的一個基因作為DNA條形碼基因就能對所有的物種進行分類鑒定，這也是不切實際的。DNA條形碼的鑒定是基于現(xiàn)在已經確定的物種，對其基因進行大數(shù)據(jù)分析才得到的。這就需要大量的科學家尤其是傳統(tǒng)生物分類學家、分子生物學家、統(tǒng)計學家以及生物信息學家等相互合作，此外也需要許多的研究機構的合作、信息的互通才能建立DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫，從而為今后物種鑒定分類做好前期基礎性工作。

DNA條形碼基因通常選擇500～1 000 bp的片段，這個長度相對于一個物種而言是非常短的，包含的信息也相對較少，因此在對于一些物種的鑒定中仍然會出現(xiàn)分析錯誤的現(xiàn)象，當然對于物種進化關系的深入研究數(shù)據(jù)量可能也不夠。對于通過DNA條形碼技術對物種進行鑒定的應用價值仍然存在爭議，這種分類方法無疑降低了傳統(tǒng)的形態(tài)學分類鑒定方法的難度，但是物種的分類只單獨通過基因的方法顯然也會增加鑒定錯誤的可能性。

3 展望

盡管DNA條形碼的分類鑒定方法存在許多問題，但是該方法在物種分類鑒定中仍然存在極大的優(yōu)勢[27-28]。因此，應該大力發(fā)展基于DNA的分類鑒定的方法，利用其快速、簡便、所需鑒定人員少等優(yōu)點，使其為地球生物的起源、進化的研究帶來質的改變。正如基于DNA條形碼分類鑒定的優(yōu)勢和局限性，我們應將DNA序列、形態(tài)學以及生態(tài)學相互結合，這樣才能更加準確地對物種進行分類鑒定。通過DNA條形碼技術無疑大大加快了地球物種分類鑒定的速度，大量的研究也同樣證明該方法的可行性。

長小蠹類昆蟲由于具有種類繁多、形態(tài)特征相似度高等特點，給形態(tài)學家?guī)砹酥T多困難。在口岸截獲的長小蠹類昆蟲，許多樣品均為卵、幼蟲、蛹及殘肢，無法從形態(tài)上進行鑒定，因此通過DNA條形碼技術可以快速方便地進行檢疫鑒定，可為害蟲的風險分析打下基礎。此外，截獲的樣品由于時間原因，蟲體內的部分DNA已經降解，可以通過研究開發(fā)微型DNA條形碼(Mini DNA barcoding)，從而增強DNA條形碼技術在長小蠹類昆蟲的檢疫鑒定應用研究。由于長小蠹類昆蟲在國內外通過分子鑒定研究的匱乏，我們需要加大對該方面的研究，增加長小蠹類昆蟲的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。不僅可以加快長小蠹類昆蟲的遺傳進化關系的研究，而且對于檢疫部門對該類害蟲的截獲、風險分析、防治均具有重要的指導意義。