蟲草培養(yǎng)基制備操作細(xì)節(jié)分析

【摘要】：培養(yǎng)人工培養(yǎng)菌絲生產(chǎn)的蟲草菌絲粉，就是百令膠囊。在這個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，主要就是菌種的培養(yǎng)，斜面接種、傳代、保存等。培養(yǎng)基的制備是整個(gè)操作過(guò)程中最基礎(chǔ)也是最重要的。蟲草培養(yǎng)基制備主要為比例配比，溶解，調(diào)PH，分裝，滅菌，定型幾個(gè)步驟。蟲草培養(yǎng)基的好壞直接影響蟲草菌種生長(zhǎng)，所以培養(yǎng)基的制備是整個(gè)操作過(guò)程中最基礎(chǔ)也是最重要的。

【關(guān)鍵詞】：人工培養(yǎng)；制備；蟲草培養(yǎng)基；

天然冬蟲夏草是昆蟲和真菌的結(jié)合體，是蟲草菌寄生于鱗翅目蝙蝠蛾[1]的幼蟲生長(zhǎng)而成。生長(zhǎng)在海拔3500—4000以上的高山草甸區(qū)，對(duì)自然環(huán)境要求特殊，因此產(chǎn)量低，再加上人們盲目的采伐，資源日趨缺乏，價(jià)格昂貴，是少有的緊缺藥材。通過(guò)用人工培養(yǎng)方法取得更多的冬蟲夏草與天然冬蟲夏草成分基本一致，可以替代天然冬蟲夏草。人工培養(yǎng)冬蟲夏草技術(shù)，使其成分相近，各種成分對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能已被廣泛證實(shí)，而且還大大的提高了產(chǎn)量，價(jià)格相對(duì)便宜，可以滿足更多人需求。人工培養(yǎng)冬蟲夏草是在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的，培養(yǎng)基是蟲草菌種生長(zhǎng)的環(huán)境，也是菌種生長(zhǎng)的必備營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它的好壞直接影響著菌絲的質(zhì)量。培養(yǎng)基的制備是整個(gè)操作過(guò)程中最基礎(chǔ)也是最重要的。

培養(yǎng)基是微生物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，是用人工方法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長(zhǎng)代謝的需要配制成的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。微生物種類繁多，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求各異，再加上實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，培養(yǎng)基的組成成分也有較大的差別。

1 成分稱量與溶解

百令膠囊的冬蟲夏草菌種比較喜歡半固體培養(yǎng)基。一般以玉米粉，葡萄糖[2]為碳源；硝酸鈉為無(wú)機(jī)氮源；牛肉膏、蛋白胨為有機(jī)氮源；硫酸鎂為無(wú)機(jī)鹽；VB1、VB2為生長(zhǎng)因子。根據(jù)培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各種成分，放入大量杯。將以量取好的純化水取出少量，倒入大量杯中，用玻璃棒攪拌使其溶解。把剩余的水倒入不銹鋼鍋加熱煮沸，倒入瓊脂粉5～10%繼續(xù)加熱至瓊脂[3] 完全熔化。在加熱過(guò)程中用玻璃棒不斷攪拌，以防瓊脂沉淀在鍋底燒焦，同時(shí)也促使它溶解。待瓊脂完全熔化后，將大量杯中以溶解的原料倒入鍋中，繼續(xù)加熱，使原料充分溶解，直到微沸為止。加熱時(shí)要控制火力，以免培養(yǎng)基爆騰而溢出容器。有些不易溶解的原料如牛肉膏，蛋白胨等可先在小容器中加少許水，加熱溶解后再倒入容器中。

2 調(diào)PH

用30%NaOH溶液和30%HCL溶液調(diào)pH，用精密PH機(jī)進(jìn)行測(cè)定。

預(yù)熱、校準(zhǔn)儀器后，即可用來(lái)測(cè)定培養(yǎng)基。先測(cè)培養(yǎng)基溶液溫度，是否已降到與標(biāo)定溶液溫度相同，如果還高于標(biāo)定溶液溫度，等培養(yǎng)基溶液降溫至標(biāo)定溶液溫度一致時(shí)再測(cè)定PH值。否則測(cè)定出的PH值是不準(zhǔn)確的。

用餾水洗電極頭部，用被培養(yǎng)基溶液清洗一次，按“讀數(shù)”鍵，把電極浸入培養(yǎng)基溶液中，用玻璃棒攪拌溶液，使溶液均勻，在顯示屏上讀出溶液的PH值。

先測(cè)定培養(yǎng)基初始PH，如PH值偏酸，則加30%NaOH溶液，偏堿則加30%HCL溶液。反復(fù)幾次調(diào)節(jié)至PH7。

其實(shí)這樣用酸堿反復(fù)調(diào)PH的方法并不好，會(huì)影響培養(yǎng)基的成分和質(zhì)量。培養(yǎng)基成分的原因，使培養(yǎng)基本身成酸性，所以直接用30%NaOH調(diào)PH。加NaOH時(shí)要慢慢地放，寧可少補(bǔ)，不可多。雖然這個(gè)方法比較麻煩，但是它不影響培養(yǎng)基的成分和質(zhì)量，而且還節(jié)約了試劑。

3 分裝

趁熱按規(guī)定的量將培養(yǎng)基分裝到茄型瓶、試管中。一般裝容器的（20-30）%量。裝量過(guò)多，培養(yǎng)基是多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混懸液，大都具有粘性，在分裝時(shí)要注意，不使培養(yǎng)基沾污瓶口或管口，以免污染棉塞，造成雜菌生長(zhǎng)。

4 滅菌

冬蟲夏草培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌[4]，主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。滅菌的時(shí)間與溫度直接影響著培養(yǎng)基的好壞。配制完畢的培養(yǎng)基，因及時(shí)進(jìn)行滅菌操作，若耽誤了時(shí)間，會(huì)因雜菌生長(zhǎng)[5]，導(dǎo)致培養(yǎng)基變質(zhì)而不能使用。特別在氣溫高的情況下，如不能及時(shí)滅菌，數(shù)小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)基就可能變質(zhì)。

根據(jù)培養(yǎng)基的成分，用途等不同，滅菌的時(shí)間也不同。冬蟲夏草菌種用的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋（118-122）℃滅菌（29-31）min。

滅菌升溫與降溫時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，會(huì)破壞培養(yǎng)基部分有效成分，并使培養(yǎng)基顏色變黃紅色，影響菌種的生長(zhǎng)。

滅菌注意事項(xiàng)，滅菌前先要排冷空氣，可以提高滅菌時(shí)升溫速度，以免升溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基長(zhǎng)時(shí)間悶于滅菌柜中，被破壞有效成分。滅菌柜內(nèi)不能放過(guò)多過(guò)擠培養(yǎng)基，以免部分培養(yǎng)基滅菌不徹底。滅菌完畢后，小排氣，以免培養(yǎng)基沖瓶口。等滅菌柜夾層溫度降至95℃，以防燙傷人員；壓力降到0KPa，方可開門去培養(yǎng)基。

5 定型培養(yǎng)

待滅菌取出后，立即輕搖試管或茄型瓶，將沾在瓶?jī)?nèi)壁上的培養(yǎng)基輕搖洗下，并將瓶底結(jié)塊搖勻，分別稀疏放入多個(gè)筐中。待培養(yǎng)基冷卻至（35-45）℃，輕緩搖勻，管口或瓶口朝上，以15℃角傾斜在木條上靜置，長(zhǎng)度一般為試管長(zhǎng)度的1/2—2/3，茄型瓶的2/3—3/4。擺放時(shí)注意不可使培養(yǎng)基沾污棉塞，冷凝過(guò)程中勿再移動(dòng)試管或茄型瓶冷卻至凝固。并在（30-35）℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天，觀察是否染菌[6]。若無(wú)染菌則放入（11-15）℃生化培養(yǎng)箱保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)人工培養(yǎng)技術(shù)，獲得與天然冬蟲夏草成分相近，免疫調(diào)節(jié)功能相似的人工冬蟲夏草，而且還大大的提高了產(chǎn)量，價(jià)格相對(duì)便宜。

雖然人工培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功，但是還不夠成熟。在菌種培養(yǎng)的時(shí)候還是常會(huì)出現(xiàn)不少問(wèn)題。如菌種生長(zhǎng)穩(wěn)定性不高，斜面培養(yǎng)生長(zhǎng)不好，有時(shí)產(chǎn)量不高等。

蟲草培養(yǎng)基就是蟲草菌種生存的根源，蟲草培養(yǎng)基的好壞直接影響著蟲草菌種生長(zhǎng)的好壞，影響著人工培養(yǎng)冬蟲夏草的質(zhì)量，影響著人工培養(yǎng)冬蟲夏草生產(chǎn)的產(chǎn)量。蟲草培養(yǎng)基是生存的源頭，控制好蟲草培養(yǎng)基制備，可以提高菌種生長(zhǎng)穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃風(fēng)，張才軍.人工培養(yǎng)冬蟲夏草提取物免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述， 2008，933（3）：1006-2084.

[2] 沈萍主編.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000

[3] 趙斌，何紹江主編.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2002

[4] 曹春林主編.中藥藥劑學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986

[5] 黃秀梨主編.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，1999

[6] 岑沛霖主編.工業(yè)微生物[M].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社，2000