豬胞內勞森氏菌lscN基因的克隆及序列分析

張敏+尹會方+屠晶

摘要：胞內勞森氏菌是豬增生性腸炎的病原，試驗設計4條引物，采用半巢式PCR從目的DNA中擴增出1 317 bp的胞內勞森氏菌lscN基因，并進行序列分析。結果表明，lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%，是勞森氏菌三型分泌系統組件的編碼基因。

關鍵詞：胞內勞森氏菌；三型分泌系統；PCR

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）12-0010-02

豬增生性腸炎（Porcine proliferative enteropathy，PPE）是由勞森氏菌（Lawsonia intracellularis，Li）感染引起的豬接觸性腸道傳染病[1]。該病主要發生在6～20周齡斷奶豬，育成豬也可感染，引起頑固性腹瀉，嚴重降低飼料轉化率，導致養豬業受到經濟損失[2]。三型分泌系統（Type Three Secretion System，TTSS）是一種跨細菌內外膜、細胞外空間和宿主細胞膜的蛋白運輸裝置，在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，現已發現存在TTSS的致病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等[3]。英國學者David G.E. Smith 在2009年運用染色體步移技術在Li分離株中鑒定到編碼TTSS的基因區域，其中lscN是為效應蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4]，因此，本試驗對lscN進行克隆及序列分析，為后續LscN蛋白的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple載體、DH5α感受態細胞、GoldenView、瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司；Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培養基由龍巖學院生命科學學院動物醫學系提供。

1.1.2 引物 從GenBank中下載lscN（LI_RS02940）的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物由上海華津生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 采用巢式PCR擴增目的片段。第一重PCR反應體系為：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物1、2各1 μL （10 pmol/L），模板DNA 1 μL，加滅菌超純水至25 μL；PCR 反應條件為：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸10 min。第二重PCR反應體系為：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物3、4各1 μL （10 pmol/L），第一重PCR產物1 μL（100倍稀釋），加滅菌超純水至25 μL；PCR 反應條件為：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸10 min。同時設立空白對照。取第二重PCR產物5 μL加入上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，用凝膠成像儀觀察并記錄結果。

1.2.2 PCR產物回收 將余下的20 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中稱重。向膠塊中加入3倍體積Buffer G，50 ℃水浴10 min，其間溫和地上下顛倒數次。然后加入1倍體積異丙醇，上下顛倒混勻。向已裝入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S，12 000 r/min離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將前面得到的溶液加入到吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中，空離2 min。將吸附柱放入1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入10 μL Buffer B，室溫靜置1～2 min，12 000 r/min離心1 min，回收得到目的片段。

1.2.3 PCR產物克隆T載體 取回收目的片段7 μL，pMD18-T載體0.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，T4 DNA ligase buffer 1 μL，4 ℃連接過夜。將連接產物5 μL，DH5α 50 μL加入1.5 mL離心管，冰浴30 min，然后42 ℃水浴90 s，接著再冰浴2 min，加入1 mL SOC，搖床振蕩培養45 min，吸取200 μL培養液涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養過夜，然后挑菌，PCR鑒定。

1.2.4 基因測序與序列分析 將陽性克隆擴大培養，送上海華津生物科技有限公司測序。對測序獲得的序列進行同源性比較分析。

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增結果

采用巢式PCR擴增目的片段。第一重PCR擴增得到1 517 bp產物，第二重PCR擴增得到1 317 bp產物（圖1），結果與預期相符。

2.2 目的片段克隆T載體結果

目的片段連接T載體后，轉化DH5α感受態細胞，37 ℃培養過夜，細菌生長情況見圖2。

挑取8個單菌落轉接100 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養基，PCR鑒定結果見圖3。1～3、5～8號菌均為陽性克隆。

2.3 目的片段測序結果與序列分析

采用NCBI網站中的BLAST工具，將lscN與GenBank中的序列進行比較，結果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%（圖4）。endprint

3 小結與討論

增生性腸炎以回腸炎和結腸隱窩未成熟細胞腺瘤樣增生為特征，引起飼料轉化率低下，豬只生長遲緩，很大程度上影響生豬產業經濟效益。勞森氏菌是增生性腸炎的致病菌，該菌專性細胞內生長，微需氧，生長要求苛刻。因此，許多分子生物學技術難于應用其上，相關研究十分有限，目前研究主要集中于運用各種測序技術尋找在勞森氏菌致病性中發揮作用的基因或蛋白。英國學者David G.E. Smith 在2009年運用染色體步移技術在其分離株LR189/5/83中鑒定到編碼三型分泌系統的基因區域，發現與耶爾森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ，然而卻未見后續報道。

TTSS與許多革蘭氏陰性菌毒力因子分泌有關，現已發現存在TTSS的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等。大腸桿菌通過TTSS改變宿主離子通道，傳遞效應蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主細胞中發揮毒力作用；沙門氏菌和志賀氏菌通過TTSS入侵宿主，影響宿主膜泡運輸[5]。耶爾森氏菌YscN蛋白為ATPase，在識別底物和啟動酶反應中起作用，為伴侶蛋白綁定效應蛋白提供能量[6]。YscO在大腸桿菌上的同源物EscO有穩定EscN結構，刺激ATPase活化的作用[7]，YscO并不發揮這樣的作用，而是識別與其綁定配體的保守基團[8]。YscQ是TTSS注射小體內環組件，由yscQ翻譯的兩個蛋白組成，可容納YscN。因此推測Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用，故本試驗對lscN克隆測序，為后續蛋白的研究奠定基礎。

目前，歐美報道的豬勞森氏菌分離株有PHE/MN1-00（美國）、NWumn05（美國）、VPB4（美國）、GB106（美國）、DBumn06（美國）、D15540（丹麥）、PHE-BR（巴西）、963/3（英國）、916/91（英國）、LR189/5/83（英國）等。GenBank中報道全基因組序列的僅有PHE/MN1-00和N343兩株。采用NCBI網站中的BLAST工具，將擴增到的lscN與GenBank中的序列進行比較，結果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%，說明該基因保守性較高。

參考文獻：

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[2] 梁正維.增生性腸炎的嚴重威脅[J].國外畜牧學：豬與禽，2000（5）：54-55.

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