豬乙型腦炎（HW1株）細胞滅活疫苗免疫抗體水平分析

周丹娜+段正贏+李文浩+郭銳+楊克禮+袁芳艷+劉澤文+劉威+陳文杰+孟麗+田永祥

摘要：為評估豬乙型腦炎（HW1株）細胞滅活疫苗的免疫原性，用商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、乙型腦炎弱毒疫苗（SA14-14-2株）以及自制乙型腦炎細胞滅活疫苗（HW1株）分別免疫仔豬，通過抗體水平監測試驗、中和抗體試驗、小鼠攻毒保護試驗分別檢測了其特異性抗體消長情況、中和抗體效價產生情況及疫苗對小鼠的攻毒保護率。結果顯示，3種疫苗均能產生中和抗體，乙型腦炎細胞滅活疫苗免疫組中和抗體水平要高于鼠腦疫苗和弱毒疫苗免疫組，乙型腦炎細胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組對小鼠的攻毒保護率高于鼠腦疫苗免疫組，但兩者之間差異不顯著?？贵w消長情況顯示，至8周觀測期結束，鼠腦疫苗免疫組的抗體陽性率為80%，乙型腦炎細胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組抗體陽性率為100%。結果表明豬乙型腦炎（HW1株）細胞滅活疫苗的免疫原性優于鼠腦滅活疫苗和弱毒疫苗。

關鍵詞：豬乙型腦炎病毒；滅活疫苗；細胞；免疫

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）12-0005-02

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis vrus， JEV）是一種危害嚴重的人獸共患傳染病原，可引起人類腦炎，平均死亡率高達20%，而幸存者中約有57%～68%留有不同程度的后遺癥[1]。全球每年感染JEV人數超過1 000萬人，亞洲每年乙型腦炎（JE）病例有5萬多人，而我國是JE發病最多的國家，占全世界當年總發病人數的80%以上，因此JE是我國公共衛生的重要問題之一[1]。據調查我國豬群JE陽性率為18.12%～46.68%，不同地域流行存在差異[2]。JEV對豬的致死率不高，主要引起繁殖障礙性疫病，但豬是JEV的主要增殖宿主和傳染源。我國豬的飼養數量大、更新快，JEV容易通過豬-蚊-豬的循環擴大病毒的傳播，預防和控制豬的感染和滅蚊是防止人患JE的重要措施。我國豬用乙型腦炎疫苗現有SA14-14-2株減毒活疫苗和HW1株鼠腦滅活疫苗。豬感染JEV后會出現較高的毒血癥，雖然已有報道SA14-14-2株穩定性較好，但主要毒力蛋白上依然有回復突變可能[3]，且SA14-14-2可在三帶喙庫蚊體內繁殖[4]，該毒株對乙型腦炎的流行與傳播的影響尚不清楚。而鼠腦滅活疫苗抗原成分較為復雜，副反應較大。因此，研究更為安全、穩定的JE疫苗是防治該病的主要方向。本研究選擇免疫保護性較好的乙型腦炎HW1株，用細胞懸浮培養來代替鼠腦增殖，制備了一批滅活疫苗，并對比了商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）以及自制乙型腦炎細胞滅活苗（HW1株）的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

乙型腦炎病毒HW1株、BHK21均由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存；20只15 kg左右的仔豬購自武漢某豬場。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、新生牛血清、青、鏈霉素購自GIBCO公司；水包油相佐劑SDA-25購自賽德奧生物科技（北京）有限公司；豬乙型腦炎油乳劑滅活疫苗購自武漢中博生物股份有限公司；豬乙型腦炎減毒活疫苗、豬乙型腦炎抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病毒增殖 采用細胞懸浮技術培養BHK21細胞至其密度為3×107個/mL。用DMEM培養基稀釋病毒至TCID50=107/mL，將病毒液與細胞懸液按1∶10的體積混合，經48 h懸浮培養后收獲培養液，反復凍融2次后，離心取上清，置于-20 ℃保存備用。

1.3.2 病毒TCID50的測定 準備長滿單層BHK-21細胞的96孔板，將待檢病JEV毒液用DMEM培養基做10倍梯度稀釋至10-5～10-10，每個稀釋度接種8個孔，每孔100 μL，并設立陰性對照孔。觀察記錄細胞病變情況，計算各稀釋度病變細胞孔的百分率。按Reed-Muench法計算待測病毒的TCID50。

1.3.3 乙型腦炎滅活疫苗的制備 將制苗用病毒液按體積加入0.2%甲醛溶液，37 ℃滅活48 h。將滅菌處理的SDA-25佐劑與病毒液按體積比1∶3乳化30 min，乳化結束前加入1%硫柳汞，定量分裝，加蓋密封，2～8 ℃保存備用。

1.3.4 仔豬免疫試驗 將20只JEV抗體為陰性仔豬隨機分為4組，每組5只。分別接種乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）、自制乙型腦炎細胞滅活疫苗（HW1株）以及PBS。商品化疫苗按疫苗說明書進行免疫，自制疫苗每只肌注2 mL，首免14 d后同等劑量加強免疫一次。所有仔豬于首免后的1、2、3、4、5、6、7、8周無菌采血，分離血清，保存于-20 ℃備用。

1.3.5 免疫抗體水平檢測 使用乙腦抗體檢測試劑盒檢測血清抗體，并使用SPSS軟件對數據進行分析。不同免疫組陽性峰值血清進行血清中和效價的檢測，具體方法為：將JEV病毒稀釋為200 TCID50，待檢血清補體滅活后倍比稀釋至2-2～2-8，將病毒與不同稀釋度的待檢血清等量混合，置于37 ℃作用60 min。每個稀釋度接種6個孔，觀察并記錄出現CPE的孔數，按Reed-Muench法計算半數保護量（PD50），然后計算待檢血清的中和效價。

2 結果與分析

2.1 病毒毒價測定

在BHK21懸浮細胞上進行HW1株的增殖，連續傳5次，其TCID50分別為106.9/mL、107.1/mL、107.5/mL、107.4/mL和107.3/mL，毒價穩定，可用于配制疫苗。

2.2 仔豬血清乙型腦炎抗體檢測及抗體消長情況

乙型腦炎弱毒疫苗免疫組在免疫1周以后抗體轉陽，鼠腦滅活疫苗和細胞滅活疫苗免疫組均在免疫后第2周抗體轉陽。鼠腦滅活疫苗在隨后的抗體監測結果與未免疫組差異不顯著。弱毒疫苗組和細胞滅活疫苗組分別在第2周和第3周出現抗體峰值，隨后逐周下降，但直至第8周抗體水平仍然呈陽性（圖1）。endprint

2.3 血清中和試驗

血清中和試驗結果（圖2）顯示，鼠腦滅活疫苗組、弱毒疫苗組和細胞滅活疫苗組的平均中和效價分別為1∶4、1∶22和1∶107。細胞滅活疫苗組高于陰性對照組、鼠腦滅活疫苗組和弱毒疫苗組，且差異均極顯著（P<0.01）。

3 小結與討論

目前我國豬乙型腦炎病主要采用弱毒活疫苗（SA14-14-2株）來進行預防控制，圍繞該毒株也進行了不少類型疫苗的研制與探索[5，6]，但該疫苗毒株源于人用疫苗毒株，且能在中間宿主蚊子體內增殖，雖然尚無該毒株反強的報道，但廣泛地應用在豬乙型腦炎病的防控中是存在一定風險的。

本研究對比了乙型腦炎鼠腦滅活疫苗（HW1株）、弱毒疫苗（SA14-14-2株）和自制細胞滅活疫苗（HW1株）對仔豬的免疫效果。從IgG抗體水平檢測以及血清中和試驗的結果來看，自制細胞滅活疫苗的免疫效果要優于鼠腦滅活疫苗（HW1株）和弱毒疫苗（SA14-14-2株），且免疫保護期與弱毒疫苗相當?？紤]到弱毒疫苗除激活體液免疫產生中和抗體外，還能引起機體的細胞免疫，下一步將開展動物攻毒保護試驗，進一步評價豬乙型腦炎（HW1株）細胞滅活疫苗免疫效果。

參考文獻：

[1] RUPINFERJEET K，MANISH R，SUDHANSHU V. Immunogenicity in mice of cationic microparticle-adsorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Vaccine， 2004，22（8）：2776-2782.

[2] 范 煜，曹瑞兵，陳溥言.2014年我國不同生態地區豬乙型腦炎野毒感染的流行病學調查[A].中國畜牧獸醫學會2014年學術年會論文集[C].廣州：中國畜牧獸醫學會，2014.

[3] 許樂燕，徐聞青，徐帆洪，等.乙型腦炎病毒SA-（14）-14-2減毒疫苗株的生物學和基因穩定性[J].中國生物制品學雜志，2008（10）：833-837.

[4] 馮 云，張海林，俞永新，等.三帶喙庫蚊胸腔接種乙型腦炎減毒活疫苗病毒的感染動態及致病力觀察[J].中國人獸共患病學報， 2007（3）：278-281.

[5] 李自力，陳煥春，徐高原，等.表達乙腦病毒PrM基因重組偽狂犬病病毒的構建[J].畜牧獸醫學報，2007，38（1）：53-58.

[6] 王曉杜，趙凡凡，代 兵，等.豬日本乙型腦炎病毒DNA復制子載體的構建及外源基因表達分析[J].畜牧獸醫學報，2015，46（1）：111-118.endprint