CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體對結直腸癌干細胞PDL-1表達的下調作用

賈良勇 許 娜 王興寧 李 慧

·基礎研究·

CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體對結直腸癌干細胞PDL-1表達的下調作用

賈良勇 許 娜 王興寧 李 慧

目的探究CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體對結直腸癌干細胞PDL-1表達的下調作用。方法

選擇結直腸癌細胞系HCT116分選出CD44、CD133/1+細胞，進行miR-425裝載納米脂質體轉染，分為對照組(轉染control載體)、實驗組(轉染miR-425慢病毒載體)，空白組以納米脂質體代替，測定干細胞生長狀態，檢測PDL-1表達水平。結果分選的CD 133/1+細胞呈圓形，12 h后開始貼壁生長，狀態良好。qRT-PCR檢測顯示實驗組的miR-425的相對表達水平為(182.44±22.19)，對照組與空白組分別為(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，實驗組明顯高于對照組與空白組(P<0.05)。MTT檢測結果表明，與空白組(0.78±0.22)、對照組(0.81±0.17)比較，實驗組(0.24±0.15)的HCT116細胞生長速度明顯減慢(P<0.05)。空白組與對照組的細胞增殖率分別為(0.48±0.14)與(0.51±0.18)，都明顯高于實驗組的(0.30±0.11)。Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)。結論CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體能抑制結直腸癌干細胞PDL-1的表達，從而顯著抑制干細胞的生長、增殖能力。

miR-425；納米脂質體；結直腸癌；干細胞；PDL-1

結直腸癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，當前在我國的發病人數越來越多[1]。現代研究表明結直腸癌的發生是一個由正常組織經過良性病變逐步演變為惡性腫瘤的過程，也是一個多步驟、多因素參與的過程，伴隨著基因水平和表觀遺傳水平改變的累積[2-3]。干細胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的早期未分化細胞，CD133分子是結腸癌干細胞的重要標記分子，CD44也可能是結腸癌干細胞的標記，并且部分CD133+細胞不表達CD44，因此CD44可作為CD133+細胞進一步純化的分子標記[4-5]。miRNA 是一類長度為21～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，可抑制靶mRNA 翻譯，對基因進行轉錄后翻譯和表達的調控，進而參與調節生物體的各種生物學行為[6-7]。多數結直腸癌經歷了正常腸組織、良性息肉、腺瘤、惡性腫瘤的演變過程，這一過程也伴隨多種miRNA表達的異常變化[8-9]。細胞程式死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)也是人類體內的一種蛋白質，由CD274基因編碼，可以傳導抑制性的信號，減少淋巴結CD8+ T細胞的增生[10]。本文探究了CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體對結直腸癌干細胞PDL-1表達的下調作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究標本

研究時間為2016年1月至2016年12月，人結直腸癌細胞系HCT116購自中國科學院上海細胞庫，培養細胞所需的DMEM培養基、胎牛血清(FBS)等購自GIBCO公司，PE標記CD44、CD133鼠抗人單克隆抗體(PE-AC133，Miltenyi Biotec)，RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，引物由上海生工合成，cDNA合成試劑盒和Real-time PCR試劑均購自Sigma公司，miR-425慢病毒載體及其對照載體、納米脂質體轉染試劑均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。所有溶液均由滅菌去離子水配制，細胞株經檢測，無支原體污染。

1.2 細胞培養與處理

HCT116細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的細胞培養箱內進行培養，培養基為高糖型DMEM，含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素。以0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1∶1混合液消化傳代，每3天傳動帶1次，每天更換培養液1次。以同型對照PE熒光強度為本底熒光，將此區域設定為CD44、CD133/1+細胞的門，計算百分比，從而分選出CD44、CD133/1+細胞與CD44、CD133/1-細胞。

1.3 miR-425轉染

將miR-425和control離心用RNase-free H2O溶解到20 μM濃度。將6×104的CD44、CD133/1+接種到12孔板中，培養24 h后，細胞生長密度達到60%時進行轉染。分為對照組(轉染control載體)、實驗組(轉染miR-425慢病毒載體)，空白組以納米脂質體代替。

1.4 細胞活力測定

轉染后的HCT116細胞生長至70%～80%時消化細胞，接種至96孔細胞培養板中，按20 μL/孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液，放回培養箱繼續孵育4 h，終止培養，吸去上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min后490 nm測定吸光度值，測定細胞活力，實驗重復3次。

1.5 細胞增殖能力測定

將轉染后的HCT116細胞以700個/孔接種于直徑3.5 cm的細胞培養皿中，每2～4 d換液1次。培養10 d后終止培養。PBS清洗1次后加入4%的多聚甲醛固定15 min，然后棄去固定液，加適量0.1%的結晶紫染色10 min，肉眼進行計數。

1.6 PDL-1表達檢測

轉染后的HCT116細胞生長密度在90%左右時，收獲細胞，裂解液分離總蛋白，采用Western blot法檢測PDL-1蛋白表達水平。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 CD133/1+細胞檢測

流式細胞儀可檢測HCT116細胞CD133/1+細胞的存在，比例占0.3%。分選的CD 133/1+細胞呈圓形，12 h后開始貼壁生長，狀態良好。

2.2 miR-425表達水平對比

轉染后進行qRT-PCR檢測，實驗組的miR-425 的相對表達水平為(182.44±22.19)，對照組與空白組分別為(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，實驗組明顯高于對照組與空白組(F=78.104，P<0.05)。

2.3 生長能力對比

MTT檢測結果表明，與空白組(0.78±0.22)及對照組(0.81±0.17)比較，實驗組(0.24±0.15)的HCT116細胞生長能力明顯減弱(P<0.05)。

2.4 增殖能力對比

結晶紫染色結果顯示，空白組與對照組的細胞增殖率分別為(0.48±0.14)與(0.51±0.18)，都明顯高于實驗組的(0.30±0.11)。見圖1。

圖1 CD133/1+細胞增殖能力的結晶紫染色檢測(×200)

2.5 PDL-1表達水平檢測

Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)。

3 討論

當前由于各種因素的影響，我國結直腸癌患者越來越多，對其的研究也逐漸深入。干細胞是器官發生過程中早期分子活動的研究工具，已成為近年來醫學和生物學領域研究的熱點[11]。CD44、CD133分子是結直腸癌干細胞的重要標記分子，CD44、CD133分子的表達是判斷結直腸癌患者生存期的獨立因素[12]。有研究表明，分離純化的CD133+細胞移植小鼠后，能在小鼠體內有效形成新的腫瘤，而CD133-細胞則不能在小鼠體內形成新的腫瘤[13]。CD44、CD133分子的表達有復雜的調控機制，也存在具有轉錄后調控機制[14]。

miRNA 作為一個廣泛存在的可對基因表達進行調控的分子，長度大約為22 bp，在維持干細胞特性方面發揮了重要作用[15]。miRNAs是保持造血干細胞內干細胞數目和特征不變的關鍵分子之一，miR-200c在乳腺干細胞的表達下調，恢復miR-200c 的表達，可明顯抑制乳腺干細胞的增殖能力。miR-21 在 CD133/1+細胞中的表達明顯下調，其可能通過調節某些致癌基因而發揮腫瘤生成的作用[16]。

在本研究中，為了解 miR-21對 CD133/1+卵巢癌干細胞增殖生物學功能的影響，我們利用脂質體 2000 介導的轉染方法，將化學合成的 miR-21 寡核苷酸轉染 CD133/1+卵巢癌干細胞，同時設立空白組及轉染無關序列的陰性對照組，分別檢測 miR-21 寡核苷酸誘導的增殖情況。本研究實驗選取HCT116細胞作為研究對象，通過CD44、CD133耦連選擇干細胞，通過慢病毒納米脂質體轉染表達miR-425，qRT-PCR驗證了HCT116細胞在穩定轉染miR-425后，miR-425表達升高。同時HCT116細胞的生長速度下降、增殖能力下降，表明miR-425能抑制HCT116細胞的生長與增殖。

實驗證實miRNA對靶基因表達調控的異常，導致和(或)促進了腫瘤的發生、發展，CD44、CD133表達不僅僅局限于結腸或結腸癌干細胞表面，并且在轉移性結腸癌組織中，CD44、CD133細胞都具有腫瘤干細胞特性[17-19]。PD1(programmed death-1)最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，PD-1有2個配體，分別是PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)。PDL-1蛋白廣泛表達于抗原提呈細胞(APCs)、活化T、B細胞、胎盤滋養層、心肌內皮、巨噬細胞，在免疫應答的負性調控方面發揮著重要作用[20]。在腫瘤細胞中，PDL-1蛋白呈現高表達狀況，有利于腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡[21]。本研究中Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)，表明miR-425能抑制結直腸癌干細胞PDL-1的表達。

總之，CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質體能抑制結直腸癌干細胞PDL-1的表達，從而顯著抑制干細胞的生長、增殖能力。

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CD44,CD133CoupledwithmiR-425LoadedNanoLiposomeonPDL-1DownRegulatedRoleintheColorectalCancerStemCells

JIALiangyong,XUNa,WANGXingning,etal.

AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yan’an,716000

ObjectiveTo investigate the PDL-1 down regulated role of CD44,CD133 coupled with miR-425 loaded nano liposome in the colorectal cancer stem cells.MethodsThe colorectal cancer cell line HCT116 were selected for CD44,CD133/1+ cells,and were given the miR-425 loaded nano liposome transfection,the cells were divided into the control group (transfected with control vector) and the experimental group (transfected with miR-425lentivirus vector),the blank group was the nano liposome,and detected the cell growth and the expression level of PDL-1.ResultsThe CD 133/1+ cells were round and grew well after 12 h.qRT-PCR test showed that the relative expression level of miR-425 in the experimental group was (182.44±22.19),while the control group and the blank group were (1.84±1.11) and (1.67±0.98) respectively,the experimental group were higher than that of the control group and the blank group (P<0.05).The results of MTT showed that compared with the blank group (0.78±0.22) and the control group (0.81±0.17),the growth rate of HCT116 cells (0.24±0.15) were significantly slower in the experimental group (P<0.05).Compared with the experimental group,the cell proliferation rate of the blank group(0.48±0.14)and the control group(0.51±0.18)were significantly higher than that of the experimental group(0.30±0.11).Western blot analysis showed that the relative expression of PDL-1 in the experimental group,the control group and the blank group was 0.33±0.13,0.76±0.21 and 0.82±0.15 respectively,the experimental group were significantly lower than the control group and the blank group (P<0.05).ConclusionCD44 and CD133 coupled with miR-425 can inhibit the expression of PDL-1 in colorectal cancer stem cells,which can significantly inhibit the growth and proliferation of stem cells.

MiR-425;Nano liposome;Colorectal cancer;Stem cell;PDL-1

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1741～1744)

716000 延安大學附屬醫院

李 慧

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.001

R735.3+5；R735.3+7

A

1001-5930(2017)11-1741-04

2017-05-09

2017-07-10)

(編輯：甘艷)