超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

黃曉榮，張 濤，馮廣朋，趙 峰，劉鑒毅，王 妤，章龍珍，莊 平

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200090）

超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

黃曉榮，張 濤，馮廣朋，趙 峰，劉鑒毅，王 妤，章龍珍，莊 平

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200090）

選取6 ind健康的雄性俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti），經(jīng)人工催產(chǎn)后獲得成熟的精子，運(yùn)用掃描電鏡和透射電鏡，觀察了超低溫冷凍前后精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，經(jīng)過超低溫冷凍后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，其中凍精頂體長度、頭中部寬度及中段寬度與鮮精相比顯著增加（P＜0.05）；中段長度及后外側(cè)延伸物與鮮精相比顯著減少（P＜0.05）。凍后有38.6%的精子在形態(tài)結(jié)構(gòu)上受到不同程度的損傷。精子的結(jié)構(gòu)損傷主要表現(xiàn)在精子頂體不明顯或與核發(fā)生糅合，后外側(cè)延伸物消失，甚至頂體脫落；精子核膜皺褶，泡狀化，膜與核之間空隙加大，有的部分甚至出現(xiàn)膜斷裂，核內(nèi)內(nèi)切溝模糊；精子中段發(fā)生膨大和變形，線粒體外膜破損，線粒體條狀嵴結(jié)構(gòu)彌散，線粒體脫落；鞭毛外鰭褶與鞭毛脫離，鞭毛與中段脫離，少數(shù)鞭毛在中段斷開。結(jié)果表明，超低溫冷凍對精子的損傷主要集中在膜系統(tǒng)，中心粒等微管系統(tǒng)基本完好。

俄羅斯鱘；精子；超低溫冷凍；超微結(jié)構(gòu)；冷凍損傷

俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）屬鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬，不僅肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，還具有藥用、美容、滋補(bǔ)功效，自古以來就被視為水中珍品［1］。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及水電工程建設(shè)等原因，鱘類資源量大幅度下降并處于瀕危狀態(tài)，已經(jīng)被國際自然和資源保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）（1996）列為易危種，1997年世界瀕危動物貿(mào)易公約組織（CITES）將其列為附錄Ⅱ［2］。因此，亟需開展其精子的超低溫冷凍保存研究工作。

在精子的超低溫冷凍保存研究中不可避免地會造成其形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷，而精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整與否又直接與精子活力相關(guān)，進(jìn)而影響精子的受精能力［3］。檢測精子超低溫冷凍前后形態(tài)結(jié)構(gòu)已被應(yīng)用于大黃魚（Pseudosciaena crocea）［4］、 點(diǎn) 帶 石 斑 魚 （Epinephelus malabaricus）［5］、真鯛（Pagrosomusmajor）［6］、蝦夷扇 貝 （Patinopecten yessoensis）［7］、 長 牡 蠣（Crassostrea gigas）［3］等魚、貝類精子質(zhì)量評估中。本研究利用掃描電鏡和透射電鏡，分析了俄羅斯鱘精子超低溫冷凍保存前后形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，旨在了解超低溫冷凍對精子的損傷機(jī)制，進(jìn)一步改善精子超低溫冷凍保存方法，以期對俄羅斯鱘種質(zhì)資源的保護(hù)以及養(yǎng)殖俄羅斯鱘種質(zhì)的改良起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實(shí)驗用親魚來源于杭州千島湖鱘龍科技開發(fā)有限公司千島湖養(yǎng)殖基地，在網(wǎng)箱中進(jìn)行養(yǎng)殖。2015年5月，在俄羅斯鱘的繁殖季節(jié)，選取年齡為7齡、體長 91.5～112.6 cm、體重 4.52～6.34 kg的雄魚6 ind用于實(shí)驗。

1.2 精子采集

雄魚經(jīng)人工催產(chǎn)后采集精子。待親魚麻醉后，用直徑6 mm左右的聚丙烯塑料軟管插入雄魚生殖孔，輕輕擠壓腹部，讓精液流入塑料袋中，要求精液無血、無水、無糞便等污染，選取活力90%以上的鮮精5 mL，用等量2.5%的戊二醛固定，4℃保存以備進(jìn)行電鏡觀察。

1.3 凍精制備

選取活力90%以上的鮮精5 mL，以10%的甲醇作為抗凍劑，以含23.4 mM蔗糖＋0.25 mM KCl＋30 mM Tris（pH 8.0）的混合溶液作為稀釋液，將精液與預(yù)冷（4℃）的抗凍保護(hù)液按1∶1（V／V）混合后，裝入250μL塑料離心管，液氮面1 cm處平衡1 min后，迅速投入－196℃的液氮中保存。解凍時，先將樣品快速提至液氮面1 cm處平衡1 min，再取出樣品于38℃水浴中解凍。凍精用等量的2.5%戊二醛固定，4℃保存以備進(jìn)行電鏡觀察。

1.4 電鏡觀察

掃描電鏡樣品制備：將固定的精液用pH 7.4的磷酸緩沖液（PBS）清洗3次后，再用1%～2%鋨酸固定1.5 h，經(jīng)PBS清洗1次，各級酒精梯度脫水，醋酸異戊酯過渡，自然干燥后噴金，置于JEOL-6380 LV掃描電鏡下觀察。

透射電鏡樣品的制備：將固定的精液經(jīng)3 000 r·min－1離心 5 min，棄上清液，再加等量 2.5%戊二醛。30 min后將沉淀從離心管中分離出來，再置于2.5%戊二醛中，4℃下保存?zhèn)溆谩悠酚胮H 7.4的PBS液漂洗3次后，再用1%～2%鋨酸固定，梯度酒精脫水，Epon 812樹脂包埋，Ultracute超薄切片機(jī)切片，切片厚度為70～80 nm。樣本經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后置于HITACHIH-600型透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 測量及數(shù)據(jù)處理

掃描電鏡下分別選取80個鮮精及凍后精子，測量其頂體長度、寬度、頭長、中段長等9組數(shù)據(jù)。精子各個部位的測量按MARTIN等［8］對精子各部的劃分和測量點(diǎn)，利用顯微圖像分析軟件（Image-Pro Plus 5.1，Media Cybernetics，USA）進(jìn)行測量。

在掃描電鏡下隨機(jī)選取80個凍后精子樣本，統(tǒng)計受損精子數(shù)。用方差分析（ANOVA）檢驗組間差異是否顯著。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子數(shù)據(jù)測量

俄羅斯鱘精子經(jīng)過超低溫冷凍后，外部形態(tài)發(fā)生了較大變化。測量結(jié)果表明，經(jīng)過冷凍后俄羅斯鱘精子頂體長度、頭中部寬度、中段寬度等顯著增加（P＜0.05）；中段長度縮短，后外側(cè)衍生物變短，凍精與鮮精有顯著差異（P＜0.05）；其它指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

表1 俄羅斯鱘鮮精與凍后精子形態(tài)比較Tab.1 Dimension of fresh and frozen-thawed semen under scanning electron m icroscopy

2.2 精子超微結(jié)構(gòu)觀察

俄羅斯鱘精子分為頂體、細(xì)胞核、中段和尾部（圖版Ⅰ-1，7）。總長為（49.05±1.58）μm（圖版Ⅰ-1）。精子頭部為細(xì)胞核，呈由前往后逐步變細(xì)的棒狀，長度為（6.98±0.56）μm。緊接細(xì)胞核的是中段，中段為矩形，長和寬分別為（2.56±0.33）μm和（0.92±0.25）μm（圖版Ⅰ-1，7）。中段后接鞭毛，鞭毛長度為（42.73±3.53）μm（圖版Ⅰ-1）。

通過對俄羅斯鱘凍精的統(tǒng)計，有約38.6%的精子出現(xiàn)不同程度的損傷，其損傷情況和損傷部位主要集中在以下幾個方面：

頂體俄羅斯鱘精子頭部頂端有明顯的頂體，呈帽狀覆蓋于精子頂端，長（0.64±0.089）μm，寬（0.86±0.099）μm（圖版Ⅰ-2，5，7，9，11）。頂體由頂體泡和亞頂體組成，兩者外都有膜包被，在頂體和亞頂體之間有頂體膜相隔（圖版Ⅰ-9）。自頂體沿精細(xì)胞長軸方向可看到若干條后外側(cè)延伸物（圖版Ⅰ-2）。經(jīng)過冷凍保存后，受損精子表現(xiàn)出頂體不明顯或與核發(fā)生糅合，后外側(cè)延伸物消失，甚至頂體脫落（圖版Ⅰ-4，8，10）。

細(xì)胞核細(xì)胞核由染色較深的電子致密物組成，核質(zhì)分布均勻，外周質(zhì)膜覆蓋，電鏡下質(zhì)膜顯雙線形結(jié)構(gòu)，膜與核結(jié)合緊密，核中無囊泡（圖版Ⅰ-7，8，9）。細(xì)胞核中有3條內(nèi)切溝，始自植入窩，一直延伸至頂體（圖版Ⅰ-7，8，9，11）。冷凍保存后，受損精子核膜皺褶，泡狀化，膜與核之間空隙加大，有的部分甚至出現(xiàn)膜斷裂，核內(nèi)內(nèi)切溝模糊（圖版Ⅰ-4，8）。

中段俄羅斯鱘精子中段由中心粒復(fù)合體、線粒體以及伸入中段的軸絲等組成（圖版Ⅰ-10）。在中段和細(xì)胞核連接處有向核內(nèi)凹陷的植入窩和纖維體結(jié)構(gòu)。在中段和細(xì)胞核連接處，細(xì)胞核向核內(nèi)凹陷形成植入窩，植入窩由膜包被呈囊狀結(jié)構(gòu)，纖維體位于植入窩內(nèi)（圖版Ⅰ-7，8，10）。植入窩之后是近端中心粒與遠(yuǎn)端中心粒組成的中心粒復(fù)合體。線粒體為不規(guī)則的卵圓形，分1～2層排列，多分布在中段的前部，線粒體中可觀察到長條形髓樣嵴結(jié)構(gòu)（圖版Ⅰ-10，14）。細(xì)胞質(zhì)鞘中也有線粒體分布（圖版Ⅰ-10，13）。經(jīng)過冷凍保存后，受損精子中段發(fā)生膨大，中段變形，部分中段直徑大于核直徑（圖版Ⅰ-4，8），線粒體外膜破損，線粒體脫落（圖版Ⅰ-3，4）；線粒體條狀嵴結(jié)構(gòu)彌散，線粒體間界限模糊（圖版Ⅰ-13），中心粒，軸絲結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化（圖版Ⅰ-10）。

鞭毛俄羅斯鱘精子鞭毛較長，為（42.73±3.53）μm（圖版Ⅰ-1）。鞭毛兩側(cè)有側(cè)鰭，側(cè)鰭的基部分布著小的顆粒狀物質(zhì)，軸絲為典型的“9＋2”微管結(jié)構(gòu)（圖版Ⅰ-12，13），側(cè)鰭所在平面與軸絲中央微管所在平面平行側(cè)鰭寬度為（0.51±0.13）μm（圖版Ⅰ-12）。側(cè)鰭在接近尾部時逐漸變窄，軸絲直徑也逐漸減小（圖版Ⅰ-6）。凍后損傷主要表現(xiàn)在鞭毛外鰭褶與鞭毛脫離，鞭毛與中段脫離，少數(shù)鞭毛在中段斷開（圖版Ⅰ-3，4，6，7，8，9，10）。

3 討論

3.1 超低溫冷凍對精子活力的影響

超低溫冷凍對精子膜系統(tǒng)的影響主要有兩個方面：第一是膜結(jié)構(gòu)損傷，在降溫過程中精子會在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，膜發(fā)生相變，膜脂晶格化，膜蛋白從膜上脫落，給精子細(xì)胞造成不可逆的損傷［9］。第二是生化損傷，在降溫過程中細(xì)胞外水分首先結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分向外流失，細(xì)胞脫水后體積變小，胞內(nèi)離子濃度增加，大分子物質(zhì)相互擠壓，pH及酶活性都會發(fā)生變化［10－12］。這兩種損傷從外觀上均表現(xiàn)為質(zhì)膜、核膜、線粒體膜、頂體膜、鞭毛外膜等膜結(jié)構(gòu)囊泡化，頂體破壞，表面破損、斷裂，內(nèi)容物消散，線粒體嵴彌失。經(jīng)過超低溫冷凍后，有38.6%的俄羅斯鱘精子表現(xiàn)出不同程度的損傷，這可能是冷凍后精子活力下降的主要原因。

3.2 超低溫冷凍對精子外部形態(tài)的影響

俄羅斯鱘精子的形態(tài)與大多數(shù)硬骨魚類精子的形態(tài)有很大的差別。大多數(shù)硬骨魚類的精子頭部呈圓形，核前方無頂體［13－18］，只是極少數(shù)魚如圓斑星鰈（Verasper variegates），在精子核前區(qū)有凹陷的特殊結(jié)構(gòu)，這種特殊的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是頂體的遺跡［19］。俄羅斯鱘精子頂體為帽狀，有后外側(cè) 延 長 物 （PLP），除 施 氏 鱘 （Acipenser schrenckii）外，西伯利亞鱘（Acipenser baerii）等 9種鱘類頂體均有后外側(cè)延伸物［20］，DILAURO等［21－24］認(rèn)為PLP在授精過程中可以錨住卵子。精子的頂體結(jié)構(gòu)和明顯的中段是鱘魚類這種古老魚類精子的特征［20］。經(jīng)過超低溫冷凍后，部分俄羅斯鱘精子的頂體前端延伸成一個棒狀結(jié)構(gòu)，受損不明顯的精子頂體長度增大。冷凍前精子樣本中未見這種現(xiàn)象，分析認(rèn)為是精子頂體內(nèi)容物排出所致。在哺乳動物中也有類似的現(xiàn)象，有學(xué)者認(rèn)為這是精子過早發(fā)生獲能和頂體反應(yīng)，精子難以穿過卵膜完成受精［25－26］。有關(guān)鱘精子頂體反應(yīng)過程及精卵結(jié)合后精子結(jié)構(gòu)變化還有待更深入研究。

3.3 超低溫冷凍對精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

冷凍前的精子細(xì)胞核由均一的電子致密物質(zhì)組成，但冷凍后部分核內(nèi)出現(xiàn)了空泡結(jié)構(gòu)，精子核中段明顯增粗。這種空泡結(jié)構(gòu)與某些硬骨魚類中的核泡較為相似，但硬骨魚中核泡是將與遺傳信息無直接關(guān)系的物質(zhì)如非組蛋白和RNA等通過外排作用從核中排出而形成的，且核泡隨著精子成熟不斷減少［27］。俄羅斯鱘精子細(xì)胞核中空泡的形成發(fā)生在冷凍后，它是否也存在如硬骨魚核泡那樣的外排作用還不得而知。精子核中段的增粗可能是由于膜泡狀化及膜破裂后外源物質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)造成的。精子中段是游動型精子的能量來源，俄羅斯鱘精子中段為矩形，比一般硬骨魚類長，可以容納的線粒體較多［17］。線粒體是精子能量貯存場所，給激活后的精子提供運(yùn)動能量。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過超低溫冷凍后，部分俄羅斯鱘精子線粒體膜破損，線粒體嵴彌散，線粒體脫落。這與王小剛等［5］對點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）精子的研究結(jié)果一致。線粒體結(jié)構(gòu)的損傷會影響精子獲能，導(dǎo)致精子活力及授精能力下降，甚至死亡。

鞭毛是精子的運(yùn)動器官，精子激活后的運(yùn)動是依靠尾部鞭毛的擺動來實(shí)現(xiàn)。研究表明，超低溫冷凍基本不會對精子微管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)造成明顯損傷［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，俄羅斯鱘精子遠(yuǎn)端中心粒（基體）是由9組三聯(lián)微管組成，鞭毛為典型的“9＋2”結(jié)構(gòu)［29］，精子鞭毛和中段的連接部位有部分精子發(fā)生斷裂現(xiàn)象。章龍珍等［27］研究認(rèn)為，精子鞭毛與中段結(jié)合處是精子由遠(yuǎn)端中心粒到鞭毛的過渡，是兩種不同的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)連接處，也是相對較為脆弱的地方，這些部位只有脆弱的膜結(jié)構(gòu)，缺少骨架結(jié)構(gòu)支撐，在超低溫冷凍中容易受到冷凍損傷，造成不同程度的脫落、斷裂等現(xiàn)象。林丹軍等［30］對大黃魚（Larimichthys crocea）精子的研究則認(rèn)為，該現(xiàn)象可能是精子在冷凍和解凍過程中頭部質(zhì)膜和尾部質(zhì)膜腫大，導(dǎo)致軸絲斷裂，斷裂的軸絲又發(fā)生移位的緣故。因此，冷凍復(fù)溫后精子活力下降與鞭毛結(jié)構(gòu)的破損密切相關(guān)。

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Effects of cryopreservation on morphology and ultrastructure of Acipenser gueldenstaedti spermatozoa

HUANG Xiao-rong，ZHANG Tao，F(xiàn)ENG Guang-peng，ZHAO Feng，LIU Jian-yi，WANG Yu，ZHANG Long-zhen，ZHUANG Ping
（Key Laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Science，Shanghai 200090，China）

To deeply understand the effects of cryopreservation on the configuration of spermatozoa，we chose Acipenser gueldenstaedti as the object，and observed the exterior shapes and interior structure of spermatozoa bymeans of scanning electron microscope and transmission electron microscope.

The adults of Acipenser gueldenstaedti were collected from Qiandao Lake，Zhejiang Province，China，the maleswere aged 7.The average length was 91.5－112.6 cm and average weight was 4.52－6.34 kg.Six mature males were selected to extract uncontaminated spermatozoa from abdomen.Sperm motility was estimated using amicroscope，sampleswith above 90%ofmotile spermatozoa were used to study.

Native semenswere diluted 1∶1 with 23.4 mM sucrose＋0.25 mM KCl＋30 mM Tris（pH 8.0）and addition 10%glycol as cryoprotectants，the sampleswere plunged in 250μL plastic centrifuge tube，samples were equilibrated for 20 min at 4℃，then equilibrated for 1 min at－20℃，and preserved in liquid nitrogen，the samples were thawed in 38℃ bath before determination.Fresh and frozen spermatozoa were fixed with 2.5%glutaraldehyde，then the sampleswere observed by electron microscope.

The sperm morphology and ultrastructure changed greatly after cryopreservation.The length of acrosome，the width of middle head and midpiece increased significantly（P＜0.05），the length of midpiece and posterolateral projections became shorter，there were significant differences between fresh and thawed sperm（P＜0.05）.About38.6%of the spermswere damaged after cryopreservation.The ultrastructure exhibition of cryodamage focused on the following aspects：the acrosome was not obvious or the acrosome mixed with nuclear，the posterolateral projections disappeared even the acrosome lost.The nuclear membrane of sperm folded and vacuolated，the gap between themembrane and the nucleus increased，membranes broke in some parts and interweaving endonuclear canals was unclear.The midpiece of sperm enlarged and deformed，mitochondrial outer membrane broke，mitochondrial stripe ridge structure dispersed and even mitochondria dropped，posterolateral fin of flagellum released from flagellum，the flagellum detached from midpiece，a few flagellaswere disconnected in themiddle.

Acipenser gueldenstaedti；spermatozoa；cryopreservation；ultrastructure；cryodamage

圖版Ⅰ 冷凍前后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)PlateⅠ Shape and structure of spermatozoa before and after cryopreservation

S 917

A

1004－2490（2017）06－0640－09

2017－06－13

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費(fèi)項目（201203065）；國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目

黃曉榮（1978－），女，博士，副研究員，從事魚類生理及低溫生物學(xué)研究。E-mail：hxr828＠126.com

莊 平，研究員。E-mail：pzhuang＠ecsf.ac.cn